简介
DNA琼脂糖凝胶电泳
RNA琼脂糖凝胶电泳
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳
参考文献
电泳是根据基质上的净电荷、大小和构象对核酸(DNA 和 RNA)和蛋白质等大分子进行分离纯化的方法。由于磷酸基团的存在,核酸具有整体负电荷。因此,它们向阳极移动的速度完全取决于它们的大小。蛋白质含有整体的正电荷或负电荷;这使得蛋白质分子能够向一个称为等电点的 pH 移动,在该等电点分子没有净电荷。通过对蛋白质进行变性,并给予它们均匀的电荷,就可以根据大小将它们分开。大分子在由琼脂糖或聚丙烯酰胺组成的基质或凝胶内电泳。由这些聚合物制成的凝胶含有孔隙,当施加电压时,蛋白质和核酸可以通过这些孔隙。
琼脂糖是从海藻中提取的多糖,通常以0.5-2%的浓度用于DNA和RNA电泳。它可形成具有合适孔径的晶格,以便核酸能够移动到正极。
图 1.核酸琼脂糖凝胶电泳
Sigma-Aldrich 可提供加入溴化乙锭的8孔、20孔和24孔预制琼脂糖凝胶。如果使用预制凝胶,则继续“凝胶通电”步骤。
也可通过以下步骤自行灌制琼脂糖凝胶。
Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒,用于从植物和真菌 (E5038)、哺乳动物细胞或组织 (G1N70, G1N10 和 G1N350)、以及血液 (NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。
为保护分离的 DNA 不被降解,建议将 DNA 溶解在 TE 缓冲液中 (T9285)。
此外,DNAstable® 试剂盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定。
掺入溴化乙锭的凝胶:
未掺入溴化乙锭的凝胶:
Sigma-Aldrich可提供 Nancy-520 (01494),这是一种可用于替代溴化乙锭的荧光染色剂。它是一种更安全、更稳定、更环保的溴化乙锭替代品。Nancy-520 的激发波长为 520 nm,发射波长为 560 nm。
掺入Nancy-520 的凝胶:
未掺入 Nancy-520 的凝胶:
图 2.水平电泳系统
琼脂糖凝胶电泳可以根据RNA的大小和完整性来评估RNA的质量。然而,由于广泛的分子内碱基配对干扰了琼脂糖凝胶上基于大小的迁移,RNA形成了各种二级结构。因此,RNA 分子必须使用甲酰胺和甲醛进行变性。
确保所有使用的设备都不含RNAses,所有使用的缓冲液都采用无RNAses的水配制。
Sigma-Aldrich可提供含/不含溴化乙锭的RNA 样本缓冲液 (R1386)
Sigma-Aldrich可提供 8 孔 RNA预制1.25% 琼脂糖凝胶 (P6222)。这种预制凝胶不含溴化乙锭。如果使用预制凝胶,则继续“凝胶通电”步骤。
也可通过以下步骤自行灌制琼脂糖凝胶。
掺入溴化乙锭的凝胶:
未掺入溴化乙锭的凝胶:
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和双丙烯酰胺(N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)反应形成高度交联的凝胶基质。丙烯酰胺凝胶可以分离长度相差仅 0.2% 的 DNA 片段。虽然蛋白质在聚丙烯酰胺上分离前必须经过SDS变性,但带负电荷的DNA分子不需要变性。与琼脂糖凝胶相比,聚丙烯酰胺凝胶可以容纳更大量的样品,并提供高分辨率的 DNA 片段。
尽管DNA的预制PAGE凝胶被广泛使用,但如果PAGE是实验室的常规程序,那么成本就很高。熟练的技术人员可以以预制凝胶的仅一小部分成本轻松制备 PAGE 凝胶。内部制备的 PAGE 凝胶可提供更好的分辨率,并有助于获得一致的结果。
包含电源、玻璃板、垫片和点样梳的垂直电泳室
* TEMED必须最后添加。
如果在寡核苷酸中加入35S或33P核苷酸,请遵循以下步骤:
图 3.垂直电泳系统
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