寡核苷酸的操作处理和稳定性

DNA寡核苷酸是相对稳定的分子（表1）。但是，它们需要一定的操作处理和储存技术，以确保无故障实验和最大限度地延长保质期。

表1.在适当储存条件下，未修饰的单链DNA寡核苷酸的大致保质期。这些值是估计值，不能保证。

重悬、储存和工作习惯

未修饰的DNA

重悬。除非要求在溶液中运输，否则所有单链DNA寡核苷酸都是以干燥形式运输的，只需重悬即可使用，但硫醇修饰的序列除外（请遵循该还原实验方案活化这些寡核苷酸）。优选弱缓冲液，例如TE（10 mM Tris，pH 7.5至8.0，1 mM EDTA）或Tris（10 mM Tris-HCl，pH 8.0），其中TE是最佳选择。如果TE不适合最终技术 / 应用，那么无菌，无核酸酶的水是第二个最佳选择。

储存方法。如表1所示，在-20℃下储存时具有最长保质期。TE缓冲液绝对是最佳选择，因为实验室级水通常是微酸性的，会缓慢降解DNA。此外，干燥的寡核苷酸也永远不是真正干燥的。总会保留一些水分，因此这会导致缓慢降解。然而，无论是干燥的还是在水中或缓冲液中，至少在2年内稳定性都不太可能有任何显著变化。

未修饰的RNA

重悬。单链RNA寡核苷酸应按照上文所述对未修饰DNA的重悬方法重悬。

储存方法。由于其化学结构，RNA不如DNA稳定。RNA容易自催化（图1）和被RNase降解，实验室中到处存在RNase，因为它们存在于脱落的皮肤细胞和普遍存在的微生物等来源中。

对于短期储存，单链RNA寡核苷酸应储存于-80 °C下TE缓冲液中。如要长期储存，最好以乙醇沉淀物的形式储存于-80 °C下。采取预防措施尽量避免接触RNases可延长保质期。

使用RNA。RNase通常含有许多二硫键，因此非常稳定。这些酶能抵抗常规消毒方法，例如高压灭菌，因此必须用强化学品才能清除。以下预防措施将有助于最大限度地减少RNA寡核苷酸暴露于RNase：

• 相信工作区 / 实验室中的所有东西都可能存在RNases污染。
• 在实验室中专门隔离一个区域只处理RNA。
• 定期用杀灭RNases的药剂清洁RNA隔离区。
• 使用经认证不含RNase的化学品、试剂和水。
• 使用RNA专用工具，例如微量移液管。
• 始终戴着手套，当接触其他表面后务必更换。

修饰的寡核苷酸

重悬。修饰的寡核苷酸，无论是DNA还是RNA，都应重悬于TE缓冲液中。这十分重要，特别是对于荧光基团，因为pH会对荧光发射强度产生很大影响。

储存方法。修饰的寡核苷酸的稳定性特征应与其所对应的未修饰的DNA和RNA相似。因此，应根据上述对DNA和RNA的建议进行储存。为防止曝光，荧光标记的寡核苷酸应避光保存。

使用荧光修饰。在使用荧光基团时为防止曝光，须将它们置于琥珀色管中，或者用箔包裹的透明管中。

双链寡核苷酸

我们的科学家发现siRNA双链体在-20°C下干燥保存可至少稳定3年。DNA双链体如果不是比这更稳定也应该同样稳定（该值只是估计值，不能保证。如想获得有保证的实验确定的有效期，请我们联系以了解有关稳定性的研究[见下文]）。

一次性等分试样

虽然反复冻融被认为会降解基因组DNA，可能是由于冰晶形成导致的剪切作用¹，但我们的科学家们发现寡核苷酸不受这些循环的负面影响。然而，将寡核苷酸等分成一次性等分试样，然后冷冻保存在-20℃下，仍然是最好的做法。这可以防止因交叉污染或泼洒等事故造成的浪费。例如，如果一管寡核苷酸洒到地板上，就得重新订购。然而，如果只是洒了一个等分试样，只需再解冻一支就行了。

制备溶液

试管标签和技术数据表上的寡核苷酸数量使用多种单位，包括光密度（OD）、微克（μg或者μg/OD）和纳摩尔（nmol）。我们的定量方法最开始用UV / Vis分光光度计读取260 nm处的吸光度以提供OD值 — 然后从OD值得出所有其他单位值（如需更多了解，请参见寡核苷酸定量）。这些数量单位均可直接用于制备原液，但其中nmol是最有用的。

有许多浓度单位，但微摩尔（μM）可能是寡核苷酸最常用的单位。在这里，作为一个示例，我们将从试管标签 / 技术数据表中给出的nmol数量开始，用详细步骤和快捷公式计算出制备100 μM原液以及10 μM工作溶液所需的量。如想更快算出结果，包括其他单位的浓度的计算，请使用OligoEvaluator™的重悬和稀释模块。

重悬的详细步计算示例

在尺寸计算时，为了避免换算混淆，我们使用基本单位。直接在nmol、μM和其他非基本单位之间进行换算很容易出错。

步骤1.将试管标签/技术数据表上的nmol数换算为摩尔数。

我们假设的寡核苷酸数量为49.9 nmol。

mol = 49.9 nmol x 1 mol 109 nmol^-1

mol = 4.99 x 10^-8
 

步骤2.将所需的100 μM原液浓度换算为摩尔浓度。

100 µM = 100 µmol L^-1

M (mol L^-1) = 100 µmol L^-1 x 1 mol 106 mol^-1

M (mol L^-1) = 1 x 10^-4
 

步骤3.使用所需原液的摩尔浓度以及摩尔数来计算重悬所需的体积升数。

1 x 10^-4 mol L-1 = 4.99 x 10^-8mol

L = 4.99 x 10^-8mol / 1 x 10^-4mol

L = 4.99 x 10^-4
 

步骤4.将升换算为微升（μL）。

体积 = 4.99 x 10^-4 L x 10⁶ µL L^-1

体积 = 4.99 µL
 

重悬的快捷计算示例

步骤1.从试管标签/技术数据表中读取nmol量，然后乘以10，得到重悬体积的微升数。

体积 = 4.99 nmol x 10

体积 = 499 µL

此快捷计算只用于制备100 µM溶液。

在本例中，向含有寡核苷酸的试管中加入499 μL水或缓冲液，然后涡旋以确保充分混合。

关于重悬的补充说明

上述重悬示例中使用了100 μM，因为它是典型的实验室原液浓度。如果制备的原液浓度远低于100 μM，则可能会有问题，因为这样会使重悬所需的体积很容易超过试管的2 mL容量。例如，如要制备示例中的这种寡核苷酸（49.9 nmol）的20 μM原液，则需要添加2.49 mL水或缓冲液。

同样，如果制备浓度高于100 μM的原液也有问题。例如，如要制备示例中的这种寡核苷酸的1000 μM原液，则需要添加49.9 µL水或缓冲液。从2 mL试管中精确移液这么小的体积会很困难。

如果制备100 μM的原液，实际上都不需要计算，也不需要在线工具，因为技术数据表上就给出了重悬所需的量。

工作溶液计算的示例

在这个示例中，我们假设最终的10 μM工作溶液的体积为20 μL，这个是PCR所用的典型体积。

步骤1.使用浓度体积公式。

C₁V₁ = C₂V₂

100 µM x V₁ = 10 µM x 20 µL

V₁ = 2 µL

在本示例中，将2 μL原液加入到反应管中，并与其他组分一起，用水或缓冲液定容至20 μL。

数量验证

我们非常注意确保OD值准确。但您可能仍需验证寡核苷酸的数量。在这种情况下，如果您有传统的紫外/可见分光光度计，方法应很简单。

执行下列步骤：

1. 将寡核苷酸重悬于400 μL水或缓冲液中。
2. 将12 μL稀释到988 μL无菌、无核酸酶的水中。
3. 读取比色皿中1 mL样品的A₂₆₀读数。
4. 确保OD值在线性范围内（~0.1至1 OD）。
5. 将样品体积的OD乘以稀释因子。
   总OD = 1 mL 样品的OD X 400/12
6. 将总OD乘以μg/OD（来自技术数据表）得到μg。 

结论

即使处理不当，大多数单链DNA寡核苷酸也足够稳定，具有良好功能，只要在到货后短期内使用。如果需要其他帮助，请通过oligotechserv@sial.com咨询我们的技术服务组。