图 1.超滤法浓缩病毒。液体可以通过膜过滤器，大的病毒颗粒被保留下来。
病毒可以在细胞培养物中繁殖以生成病毒库。对培养细胞用来自种子病毒、商业来源或感染组织的病毒原种进行接种。在完成细胞培养后，受感染的细胞会发生裂解，可以收获病毒颗粒，也可以直接从细胞上清液中收获释放的病毒。然后对病毒原液进行滴定、等分并储存在-80°C下，以备后用。
从临床样本中分离病毒也需要利用细胞培养进行病毒传播。通过样品均质化和将其提取到液体培养基中来制备临床样品，然后将其离心并用于接种细胞培养物。
为了获得高滴度病毒库，有必要对纯化的病毒颗粒进行浓缩。配有再生纤维素膜的Amicon® Ultra和 Centricon® Plus离心式超滤管可用于浓缩病毒颗粒和病毒溶液（图1）。该方案描述了如何使用Amicon®和Centricon®离心超滤管浓缩三种常见类型病毒：慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。
病毒传播的一般方法
- 包膜细胞：将宿主细胞铺板以达到80-85%的汇合率。
- 转染：用活病毒颗粒感染细胞。
- 收获病毒：根据病毒的不同，使用细胞上清液或沉淀细胞，或两者一起来纯化重组病毒颗粒。采用四轮冷冻/解冻循环以从细胞中释放病毒，然后通过离心将细胞碎片与细胞裂解液分离开来。
- 病毒纯化：通过密度梯度超离心或柱/膜层析从细胞裂解物中纯化病毒。
- 使用Amicon® Ultra和Centricon® Plus 70 装置进行被动透析、洗滤或离心超滤，对纯化病毒溶液进行浓缩，并将缓冲液更换为合适的原液。
高滴度病毒库的病毒浓度
为了生产高滴度病毒库，对纯化病毒使用离心超滤进行浓缩是非常关键的。正确选择设备、膜材料、分子量限制或截留、离心速度、离心时间和缓冲液组分对于获得高回收率感染性病毒颗粒而言至关重要。Amicon® Ultra离心超滤管的标称分子量限制 (NMWL)对应于其滤膜类型。50 kDa NMWL的Ultracel® Amicon® Ultra 离心超滤管可以浓缩腺病毒和腺相关病毒 (AAV) 溶液。慢病毒浓缩使用50 kDa和100 kDa NMWL膜装置。
在选择超滤方法和膜标称分子量大小时，需要考虑：
- 病毒粒径：可根据公开资料估计大小，或通过显微镜、激光衍射和动态光散射等测量技术观测大小。
- 溶液中主要分离目标的大小：蛋白、抗体、药物、化学品等待分离颗粒大小会影响膜大小的选择。
- 样品体积：≤0.5 mL到70 mL范围的样品处理量适合离心超滤(cUF)装置。
为了保留病毒颗粒，滤膜的截留分子量需要小于颗粒（比病毒颗粒的分子量小约 2 倍），但也要足够大，以允许较小的成分过滤通过
（表1）。
使用Amicon® Ultra 离心超滤管浓缩病毒
表 2 显示了粗制细胞裂解物和层析纯化病毒中腺病毒、慢病毒和AAV的浓度结果。通过使用Amicon® Ultra 离心超滤装置将病毒颗粒有效浓缩至高滴度，同时获得高回收率。
请务必牢记：大多数病毒是没有办法有效浓缩、储存在低盐缓冲液中的。如果病毒在 < 250 mM 盐溶液中处于离心浓度，会导致病毒发生聚集，并降低感染性。
浓缩病毒原液可通过 0.22 µm 过滤器进行过滤灭菌。Ultrafree®-MC GV过滤装置可用于 < 0.5 mL 的体积。
结论
我们开发了一种方法来验证：如果使用 Amicon® Ultra 和 Centricon® Plus 离心设备来进行超滤，能否快速且经济有效地获得高滴度病毒。该方法可利用细胞培养上清液、细胞裂解物和其他作为来源浓缩病毒。浓缩后，可以使用 Ultrafree® 过滤装置对病毒原液进行过滤灭菌。为了在最大程度上提高感染性病毒颗粒的回收率，应选择合适的超滤装置、膜过滤器、截留分子量 (MWCO)、离心速度和离心时间。
离心超滤管
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