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Protein AQUA™应用

2003年6月,Steve Gygi博士带领团队开发了一项创新策略Protein AQUA——使用稳定同位素标记多肽和HPLC-MS技术对蛋白质进行绝对定量分析。仅仅是应用一种常见原理,即在蛋白分析中使用标记分子作为内标,Gygi团队就提升了蛋白研究人员对复杂生物样本的定量能力,并提供了一种新颖宝贵的蛋白质组学工具。

AQUA肽只是对应目标肽段的合成胰酶酶解肽段。每个AQUA肽掺入一个稳定同位素标记氨基酸,分子量略微增加(6-10道尔顿)。合成的AQUA肽与天然肽段混合后,在色谱共洗脱,在电泳共迁移,并以相同强度电离。不过,通过质谱可轻松区分天然肽与AQUA合成肽。

在常见的AQUA实验中,会将已知量的AQUA肽混入生物蛋白样本。接着消化样本并用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)分析。生成天然肽和合成的AQUA肽内标的提取离子流色谱图。根据峰值比计算天然肽含量。

蛋白AQUA是一项强大的使能技术,应用前景广阔。对于蛋白质组学研究者而言,它不仅有助于特异性蛋白表达的定量重点研究,也有助于特异性氨基酸修饰。

验证基因沉默

基因沉默验证代表AQUA技术可作为强大的新型应用工具。最近,我们证实了AQUA定量法可有效测量沉默基因表达和验证敲低成功(图1)。相比传统方法,AQUA定量法在测量沉默基因表达方面更具优势:

  • AQUA法的灵敏度仅受制于质谱仪灵敏度,可用于研究低丰度蛋白水平的基因沉默,或检测极低表达水平的沉默基因。相比传统的蛋白印迹法和酶联免疫法具有明显优势。
  • 即使没有分离得到天然肽或不存在相应抗体,仅使用一条氨基酸序列也可合成AQUA™肽。因此,AQUA法可用于测量任何沉默基因,而蛋白印迹法等其他方法则不可。
  • AQUA定量法可测量蛋白(及相应多肽)表达。相比定量PCR或RNA印迹法,能更准确评估沉默效率(相关性更高)。
图1:HeLa培养物用人GAPDH(9.6nM、19nM和38nM)的siRNA、RISC free(无功能、无干扰)、两个无干扰序列和一个无干扰池(pool)转染。另外进行4项转染试剂对照试验。转染细胞再培养48小时。蛋白提取、沉淀、定量加入AQUA™肽、胰酶酶解,并用反相LC-MS分析。生成取自GADPH的天然和AQUA™肽段的提取离子流色谱图;基于峰面积比计算GAPDH浓度。

图1:图1:HeLa培养物用人GAPDH(9.6nM、19nM和38nM)的siRNA、RISC free(无功能、无干扰)、两个无干扰序列和一个无干扰池(pool)转染。另外进行4项转染试剂对照试验。转染细胞再培养48小时。蛋白提取、沉淀、定量加入AQUA™肽、胰酶酶解,并用反相LC-MS分析。生成取自GADPH的天然和AQUA™肽段的提取离子流色谱图;基于峰面积比计算GAPDH浓度。


去除高丰度蛋白提高蛋白-AQUA™法灵敏度

一直以来血浆蛋白质组学的研究基本上受限于本身广泛的动态范围(跨越10个数量级)。诊断价值极高的低丰度蛋白因高丰度血清蛋白的存在而湮没。最近,Jeffrey Porter和团队开发了一种可对各种人血清低丰度蛋白进行定性定量的策略,需结合ProteoPrep® 20血浆免疫去除试剂盒和蛋白AQUA™技术。这一联合技术可用于富有生物学和诊断价值蛋白质的靶向发现方法(图1)。

下载海报,了解更多实验信息免疫亲和去除20种最高丰度人血清蛋白进行低丰度蛋白质组的绝对定量分析

全血和ProteoPrep® 20去除样本中凝溶胶蛋白的AQUA™法分析。全血中內源性凝溶胶蛋白肽段——GASQAGAPQGR的SRM分析结果为复杂的色谱图(图A),分辨率差且信噪比低。而用去除血浆分析时(图C),內源性凝溶胶蛋白肽段易于从干扰物中分离和鉴定,还可比对AQUA™肽内标轻松计算浓度。

图2:全血和ProteoPrep® 20去除样本中凝溶胶蛋白的AQUA™法分析。全血中內源性凝溶胶蛋白肽段——GASQAGAPQGR的SRM分析结果为复杂的色谱图(图A),分辨率差且信噪比低。而用去除血浆分析时(图C),內源性凝溶胶蛋白肽段易于从干扰物中分离和鉴定,还可比对AQUA™肽内标轻松计算浓度。


镓-IMAC离心柱富集提高磷酸肽AQUA™法灵敏度

磷酸化肽段的质谱分析通常会受到固有的低丰度和低离子化效率的限制。最近,John Dapron带领的团队提供了一种有效的策略以增强磷酸肽MS信号水平,并使用蛋白AQUA™法定量分析特异磷酸肽。Dapron使用基于微离心柱的镓-固定化金属离子亲和色谱(IMAC)和磷酸化AQUA™肽,可在不同生物条件下轻松富集、鉴定和定量特异性磷酸肽。实验过程中,Dapron结合镓-IMAC微离心柱与蛋白AQUA™法,成功检测灵敏度水平。他在大肠杆菌蛋白消化物中加入磷酸化和无磷酸化AQUA™肽混合物对照(39ng、3.9ng和390pg水平),接着用微离心柱富集,再通过LC-MS分析洗脱组分。提取离子流色谱图显示可轻松检测39ng和3.9ng水平。使用单反应监测(SRM)可轻松检测390pg磷酸肽。

镓-IMAC离心柱富集提高磷酸肽AQUA™法灵敏度