以过氧化物酶 (EC 1.11.1.7) 2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）为基质的酶分析

文档记录

替换 SPABTS02。更新规程，以符合当前的 QUMAS 格式指南。请参阅 CR SOP-DEK-ENZ42。

1.目标

建立以 2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）为基质的过氧化物酶测定方法。

2.适用范围

本规程适用于所有使用 2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）作为基质的具有过氧化物酶活性规格的产品。

3.定义

3.1.    纯水 – 来自去离子系统的水，在25 ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2.    单位定义-一个单位在 25 °C ph 5.0 下每分钟将氧化 1.0 μmole 的 2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。

3.3.    ABTS-2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。ABTS 是德国宝灵曼公司的注册商标。

4.讨论

H₂O₂ + ABTS   ^{过氧化物酶}  > 2H₂O+ 氧化型ABTS

5.责任

任何分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1.    条件
T = 25°C，pH = 5.0, A405nm，光路 = 1 cm

7.2.    方法 连续分光光度法测定

7.3.    试剂：

7.3.1.    100 mM 磷酸钾，pH 5.0，25 °C（缓冲液） 使用一元磷酸氢钾制备纯净水中的13.6 mg/mL溶液，产品编号 P5379。使用 1N KOH 在 25 °C 下调节该溶液的 pH 至 5.0。

7.3.2.9.1 mM ABTS（基质）使用ABTS （产品编号 A9941）在试剂7.3.1中制备5.0 mg/mL溶液。检查该溶液的 pH 值，必要时在 25 °C 下调节至 5.0。产品编号 A9941 以10 mg片剂的形式提供。新鲜制备。

7.3.3.0.3% (w/w) 过氧化氢溶液 (H2O2) 使用过氧化氢 30% (w/w) 溶液在纯化水中配制 0.3% (w/w) 溶液，产品编号H1009。新鲜制备。

7.3.4.40 mM 磷酸钾缓冲液，含 0.25% (w/v) 牛血清白蛋白和 0.5% (v/v) Triton X-100，pH 6.8，25 °C（稀释液）

7.3.4.1.在纯化水中配制含有以下成分的溶液：

7.3.4.1.1.    5.4 mg/mL 磷酸钾，一元，产品编号P5379。

7.3.4.1.2.    2.5 mg/mL 白蛋白，牛，V 级分粉末，产品编号A4503。

7.3.4.1.3.    5.0 mg/mL Triton X-100，产品编号T6878。Triton 是美国联合碳化物公司的注册商标。

7.3.4.2.    使用 1N KOH 在 25 °C 下调节该溶液的 pH 至 6.8。

7.3.5.    过氧化物酶酶溶液（Enzy）

7.3.5.1.    在冷试剂7.3.4中配制10 mg/mL过氧化物酶原液。

7.3.5.2.    临用前，用冷试剂7.3.4稀释至0.20-0.80单位/mL。

7.4.    操作流程

7.4.1.    将下列试剂（毫升）移入合适的比色皿中：

7.4.2.    让比色皿在25 °C下在适当恒温的分光光度计中平衡约5分钟，然后加入：

7.4.3.    立即通过反转混合并记录A_{405 nm}的增加，持续约3分钟。最快的速度通常在第一分钟。如果要运行多个酶水平，则一次测试一个。

7.4.4.    获得ΔA₄₀₅ nm/分钟以获得测试和空白的最大线性速率。

7.5.CALCULATIONS

3.05 = 反应的最终容量（毫升）
    DF = 酶的稀释因子 36.8 = 在A405nm处的氧化ABTS的毫摩尔消光系数    0.05 = 使用的酶的容量（毫升）

7.6.    最终测定浓度
在 3.05 mL 反应混合物中，最终浓度为 96 mM磷酸钾，8.7 mM 2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.01% (w/w) 过氧化氢，0.004% (w/v) 牛血清白蛋白，0.008% (v/v) Triton X-100和0.01-0.04单位过氧化物酶。

8.参考文献和附件

8.1.    Keesey, J. (1987) Biochemica Information, First Edition, pp. 58, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN

8.2.    Pütter, J. and Becker, R. (1983) Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 3rd ed., Vol III, pp. 286-293, Verlug Chemie, Deerfield Beach, FL

9审批

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