蛋白质-DNA相互作用对于信号传导、基因转录、染色体分离、DNA复制/重组以及表观遗传调控等细胞功能具有重要作用。染色质免疫沉淀(ChIP)20技术为蛋白质-DNA相互作用体内研究提供了一种快速、可靠的方法。
我们Imprint染色质免疫沉淀试剂盒利用检测板系统,可实现快速的高通量ChIP检测。这种检测板方法限制了检测过程的灵敏度,因此,该试剂盒适用于表征高丰度的蛋白质-DNA事件,如组蛋白或RNA聚合酶II事件。该方案针对从100,000-250,000个细胞/ ChIP反应/孔中分离的染色质进行了优化。增加每孔中的细胞,可能会增强非特异性背景结合并减少靶标富集。
Imprint ChIP操作步骤适用于高丰度的已知蛋白质-DNA相互作用的动力学或药物筛选研究。13, 14 该操作步骤采用一种简化方法,先从哺乳动物细胞或组织的交联开始,然后进行染色质分离。随后,在抗体包被的微孔中剪切并捕获染色质、逆转交联并使用纯化柱分离DNA。
CHP1试剂盒可在一天内对哺乳细胞或组织的DNA完成免疫沉淀和分离,速度快于任何其他商业试剂盒。该试剂盒包括小鼠IgG、抗RNA聚合酶II以及人GAPDH引物,作为阴性和阳性对照。所得DNA适用于从单靶标鉴定到全基因组图谱分析技术的各种下游应用。此外,经优化的GenomePlex全基因组扩增(WGA)方法可用于扩增ChIP DNA。15, 16, 18
试剂盒组件 |
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优化样品的剪切条件:
制备剪切染色质所使用的设备和样品类型可能对于实验的成败具有重要影响。CHP1试剂盒针对已知的蛋白质-DNA事件而设计,因此增加了少量试剂以供优化使用。另外,还额外提供了细胞核制备缓冲液、匀浆缓冲液和剪切缓冲液供4个样品优化使用。有关更多信息,参阅故障排除指南。
超声处理法已针对每个细胞系和仪器进行了优化。我们建议使用Diagenode Biodisruptor(水浸超声),以实现可重复的超声处理。良好的起始点为在高“H”档位以
30秒“开/ON”和30秒“关/OFF”循环超声5、10和15分钟。
跑胶检查超声结果:
i)使用10 µL样品并加入40 µL H2O ii)加入2 µL的5 M NaCl(终浓度为0.2 M NaCl)逆转交联。 iii)煮沸15分钟。 iv)恢复至室温后,加入1 µL 10 mg/mL RNase A并在37 °C孵育10分钟 v)使用GenElute PCR Clean-Up Kit(NA1020)纯化和分离DNA。 vi)在凝胶上上样1和4 µL超声DNA并确定条带大小。 vii) DNA条带在200 bp至1 kb之间且峰值出现在500 bp(2-3个核小体)左右的超声条件应被用于ChIP反应。
充分混匀试剂。检查试剂是否含有沉淀物。如有任何试剂形成沉淀,应在55 °C温育至沉淀溶解。使用前,使试剂恢复至室温。
洗涤液:使用12 mL(24次反应)或44 mL(96次反应)乙醇(无水,分子生物学级别)稀释浓缩洗涤液。每次使用后,拧紧稀释洗涤液的瓶盖以防止乙醇挥发。
1.25 M甘氨酸:制备1.25 M甘氨酸储液。在不使用时,保存在2-8 °C。6个月后,应重新制备新储液。
65 °C培养箱:将水浴器、培养箱或杂交箱预热至65 °C。
I. 抗体与检测孔结合
II.A.细胞培养样品制备
II.B.组织样品制备
III.蛋白/DNA免疫沉淀
IV.交联逆转
V. DNA纯化
ChIP DNA的定量
从ChIP反应中获得的模板量取决于多种因素:细胞数量和类型、处理方法、超声剪切获得的模板长度等。通常,通过简单的分光光度(A260)读数无法准确定量样品浓度。采用以下两种推荐方法,有可能解决这种次要的技术难题。
PCR条件(已提供引物集)
如果采用传统PCR或qPCR方法,则可以使用试剂盒提供的对照人GAPDH引物作为人源材料的阳性对照
(246 bp扩增子)。如果使用SYBR® Green JumpStart Taq ReadyMix™(S4438),则使用以下循环参数:
hGAPDH正向引物caattccccatctcagtcgt
hGAPDH反向引物tagtagccgggccctacttt
其他来源的ChIP材料将需要由用户设计的对照引物。传统PCR的循环数也需要由用户优化。
扩增(可选)
在ChIP之后,只有几纳克的模板可供下游应用使用。扩增该模板可扩大全基因组分析的数量和范围。
GenomePlex全基因组扩增(WGA)已被证明是一种有效的ChIP DNA扩增方法。15, 16, 18 该试剂盒利用基于基因组DNA初始切口的专利扩增技术来扩增模板,以用于后续的独特双功能引物的杂交。引物的一个功能是对整个基因组中大约每500bp区域进行代表性退火。退火后,相邻模板被扩展以创建PCR可扩增的OmniPlex®片段,其侧翼为通用引发位点,从而创建一个代表整个基因组的文库。随后,使用与初始引物序列互补的通用寡核苷酸引物对OmniPlex文库进行PCR扩增,这是WGA引物的第二个功能。
GenomePlex全基因组扩增(WGA)试剂盒被推荐用于18扩增免疫沉淀的DNA,并作以下修饰。
故障排除指南 |
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细胞数量能否增加?本试剂盒可使用的最大和最小细胞数是多少?
该试剂盒适用的细胞数范围为0.2–2.5 x 105/孔/ChIP样品。若每孔细胞数超过50万,将增加非特异性结合并降低ChIP反应的得率和特异性。如果下游应用(ChIP-Seq.、ChIP-chip)需要更高的ChIP DNA得率:a) 对多个单独的ChIP反应进行连续洗脱(用50 µL洗脱缓冲液)并将洗脱的DNA合并;或b) 选择一种全基因组扩增试剂盒(WGA2或WGA4)扩增DNA。
如果超声处理不起作用,试剂盒是否与裂解酶兼容?是的,也可以通过酶(微球菌核酸酶,MNase)消化(试剂盒中未提供的试剂/方案)得到剪切染色质。用户必须根据所用细胞系优化MNase处理的用量、温度和持续时间。
这个试剂盒能和植物一起使用吗?爬行动物细胞呢?
适用,该试剂盒可用于来自植物或爬虫类动物细胞的超声剪切染色质,前提是用户具有交联和制备合适大小的超声剪切染色质的优化条件。
ChIP后分析如何分析qPCR数据?
如何计算“% Input”和“富集倍数”?
ChIP-qPCR数据分析(ΔΔCt方法)17,19
i. 使用相同qPCR检测的Input DNA组分Ct值(ΔCt)对每个ChIP DNA组分的Ct值进行归一化,以排除染色质样品制备差异的干扰。
ΔCt [归一化ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] - Log2 (Input稀释系数)))
其中,Input稀释系数=(input染色质百分比)-1默认Input百分比为1%,即稀释系数100或6.644个循环(即100的log2)。因此,从1% Input样品的Ct值中减去6.644,如上述方程所述。
计算重复样品的平均均一化ChIP Ct值。
ii.计算每个ChIP组分的% Input(均一化ChIP ΔCt的线性转换)。
% Input = 2 (-ΔCt [均一化ChIP])
iii.用均一化ChIP组分Ct值减去均一化背景[非特异性(NS)抗体]组分Ct值(第一个ΔΔCt)
ΔΔCt [ChIP/NS] = ΔCt [均一化ChIP] - ΔCt [均一化NS]
iv.计算样品特异性背景下的检测位点IP富集倍数(Assay Site IP Fold Enrichment)(第一个ΔΔCt的线性转换)。
富集倍数 = 2 (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
Bioruptor为Diagenode SA商标。
GenomePlex和OmniPlex 为Rubicon Genomics, Inc的注册商标。
Quant-iT为Invitrogen的商标。
SYBR为Molecular Probes, Inc的注册商标。
Parafilm为American Can Co的注册商标。
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