试剂和设备
在下表的材料表中可找到许多此类产品。
- 福尔马林固定石蜡包埋组织切片
- 0.01 M 磷酸盐缓冲液,pH 7.4 (PBS)(货号 P3813 或P4417-片剂)
- 牛血清白蛋白(BSA)(货号A9647)
- 稀释液:1% BSA的PBS溶液(货号P3688)
- 二甲苯(货号247642或534056)
- 无水乙醇(货号32221(仅限欧洲)或E7023)
- 0.1% 胰蛋白酶PBS溶液(货号T7409)或4mM胰蛋白酶片剂(货号T7168)CaCl2溶液,200 mm Tris,pH 7.7,或0.1% 蛋白酶(货号P5380)PBS溶液。
- 微波抗原修复液:10 mM柠檬酸钠(货号C8532)缓冲液,pH 6.0;1 mM EDTA (货号 ED4SS),pH 8.0
- 一抗
- 选项1:生物素标记二抗及ExtrAvidin-过氧化物酶(货号
E2886)或ExtrAvidin-碱性磷酸酶(E2636)或选项2:偶联过氧化物酶或碱性磷酸酶的二抗 - 使用过氧化物偶联二抗或ExtrAvidin-过氧化物酶:3%过氧化氢(用30%储存液以及去离子水新鲜制备)。
- 酶底物:取决于酶及所需颜色(参见“底物”部分)。
- 对于过氧化物酶:AEC染色试剂盒(货号AEC101),DAB(货号 D4418或D0426).
- 使用碱性磷酸酶时:Fast Red TR/Naphtol AS-MX (货号B5655)。
- 梅氏苏木精(货号MHS1)
- Coplin染色缸(货号S5641)
- 微波炉
- 显微镜
IHC操作步骤
- 制片
- 一抗反应
- 二抗反应
- 底物制备
- 显色
- 复染
制片
脱蜡并水化 | 抗原修复 | 内源性过氧化物酶失活
脱蜡并水化
- 将玻片置于56-60 °C的烤箱中15分钟,(注意:烤箱温度不得高于60 °C)
- 转移至二甲苯溶液中,每隔5分钟换一次二甲苯,换两次。
- 将多余液体甩干并对玻片进行水化,每3分钟换一次新鲜无水乙醇,换两次。
- 将多余液体甩干并将玻片置于90%的乙醇中3分钟。
- 将多余液体甩干并将玻片置于80%的乙醇中3分钟。
- 用自来水玻片进行温和的润洗30秒(避免直接冲洗以造成松散区域脱落)。
- 浸泡于PBS中以进一步水化(室温30分钟)。
抗原修复
注意:该步骤仅在无染色或染色很弱时才进行,或根据一抗说明书要求抗原进行修复时才进行。
根据抗体及抗原,有多种可行办法用于抗原的修复:
酶修复:
- 使用0.1%胰蛋白酶的PBS溶液,37 °C孵育2-30分钟。延长孵育时间可能会增强特异性染色的效果。在PBS中润洗10分钟。
微波修复:
- 用去离子水洗涤玻片并加入至含有抗原修复液的塑料微波炉用染色缸。确保玻片被溶液完全覆盖。
- 在高功率(约700瓦)条件下微波处理5分钟。确保玻片仍被修复液完全覆盖,否则加入新鲜的修复液重复微波处理。
- 该过程可重复2-3次。
- 进行下一步处理前,室温缓慢冷却至少20分钟。
内源性过氧化物酶失活
注意:仅在使用过氧化物酶偶联二抗或ExtrAvidin-过氧化物酶时进行该步骤。
- 将玻片置于平坦的水平表面。避免玻片之间相互接触。避免玻片晾干。
- 加入足量的3%过氧化氢来覆盖整张切片。
- 室温孵育5分钟。
- 用洗瓶进行PBS润洗。
- 将玻片浸泡在PBS中2分钟。