石蜡包埋组织的免疫组织化学操作步骤

下面的操作流程描述了对福尔马林固定石蜡包埋组织切片使用过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联物免疫组化标记的应用。

试剂和设备

在下表的材料表中可找到许多此类产品。

1. 福尔马林固定石蜡包埋组织切片
2. 0.01 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (PBS)（货号P3813 或P4417-片剂）
3. 牛血清白蛋白（BSA）（货号A9647）
4. 稀释液：1% BSA的PBS溶液（货号P3688）
5. 二甲苯（货号247642或534056）
6. 无水乙醇（货号32221（仅限欧洲）或E7023）
7. 0.1% 胰蛋白酶PBS溶液（T7409）或4mM胰蛋白酶片剂（货号T7168）CaCl2溶液，200 mm Tris，pH 7.7，或0.1% 蛋白酶（货号P5380）PBS溶液。
8. 微波抗原修复液：10 mM柠檬酸钠（货号C8532）缓冲液，pH 6.0；1 mM EDTA (货号ED4SS)，pH 8.0
9. 一抗
10. 选项1：生物素标记二抗及ExtrAvidin-过氧化物酶（货号
    E2886）或ExtrAvidin-碱性磷酸酶(E2636)或选项2：偶联过氧化物酶或碱性磷酸酶的二抗
11. 使用过氧化物偶联二抗或ExtrAvidin-过氧化物酶：3%过氧化氢（用30%储存液以及去离子水新鲜制备）。
12. 酶底物：取决于酶及所需颜色（参见“底物”部分）。
13. 对于过氧化物酶：AEC染色试剂盒（AEC101），DAB（货号 D4418或D0426）.
14. 使用碱性磷酸酶时：Fast Red TR/Naphtol AS-MX （B5655）。
15. 梅氏苏木精（货号MHS1）
16. Coplin染色缸（货号S5641）
17. 微波炉
18. 显微镜

IHC操作步骤

1. 制片
2. 一抗反应
3. 二抗反应
4. 底物制备
5. 显色
6. 复染

制片

• 脱蜡并水化
• 抗原修复
• 内源性过氧化物酶失活
  

脱蜡并水化

1. 将玻片置于56-60 °C的烤箱中15分钟，（注意：烤箱温度不得高于60 °C）
2. 转移至二甲苯溶液中，每隔5分钟换一次二甲苯，换两次。
3. 将多余液体甩干并对玻片进行水化，每3分钟换一次新鲜无水乙醇，换两次。
4. 将多余液体甩干并将玻片置于90%的乙醇中3分钟。
5. 将多余液体甩干并将玻片置于80%的乙醇中3分钟。
6. 用自来水玻片进行温和的润洗30秒（避免直接冲洗以造成松散区域脱落）。
7. 浸泡于PBS中以进一步水化（室温30分钟）。

抗原修复

注意：该步骤仅在无染色或染色很弱时才进行，或根据一抗说明书要求抗原进行修复时才进行。

根据抗体及抗原，有多种可行办法用于抗原的修复：

酶修复：

1. 使用0.1%胰蛋白酶的PBS溶液，37 °C孵育2-30分钟。延长孵育时间可能会增强特异性染色的效果。在PBS中润洗10分钟。

微波修复：

1. 用去离子水洗涤玻片并加入至含有抗原修复液的塑料微波炉用染色缸。确保玻片被溶液完全覆盖。
2. 在高功率（约700瓦）条件下微波处理5分钟。确保玻片仍被修复液完全覆盖，否则加入新鲜的修复液重复微波处理。
3. 该过程可重复2-3次。
4. 进行下一步处理前，室温缓慢冷却至少20分钟。

内源性过氧化物酶失活

注意：仅在使用过氧化物酶偶联二抗或ExtrAvidin-过氧化物酶时进行该步骤。

1. 将玻片置于平坦的水平表面。避免玻片之间相互接触。避免玻片晾干。
2. 加入足量的3%过氧化氢来覆盖整张切片。
3. 室温孵育5分钟。
4. 用洗瓶进行PBS润洗。
5. 将玻片浸泡在PBS中2分钟。

一抗反应

注意：

a. 在进行一抗反应前用5% BSA对样本预孵育10分钟可降低背景染色。针对动物组织，可采用同二抗相同来源物种的5-10%正常血清获取最佳效果。
b. 在使用前根据不同的一抗选择最合适的稀释浓度和孵育时间。

1. 晾干玻片，将多余液体甩干并小心擦拭切片周围的玻片。
2. 将一抗或阴性对照试剂稀释至最佳浓度。稀释液本身也可用作阴性对照。同时也应该使用阳性对照玻片（已知含有相应抗原组织）
3. 加入100ul 一抗溶液至对应玻片，并覆盖组织切片。
4. 将玻片向两个不同的方向进行倾斜，确保液体在玻片上均匀分布。
5. 在加湿室内37 °C孵育至少60分钟。对于低丰度抗原可采用更长的孵育时间。
6. 用洗瓶进行温和的PBS润洗。将玻片浸泡在PBS中5分钟。

二抗反应

• 选择1 - 生物素/ExtrAvidin检测
• 选择2 – 酶标二抗

选择1 - 生物素/ExtrAvidin检测

1. 参照前述操作，待玻片晾干后甩干多余液体并小心擦拭。
2. 将生物素偶联二抗稀释至最佳浓度。
3. 每张玻片上加入100ul，覆盖整个组织切片。
4. 将玻片向两个不同的方向进行倾斜。
5. 在加湿室内室温孵育至少30分钟。
6. 用洗瓶进行温和的PBS润洗。
7. 将玻片浸泡在PBS中5分钟。

ExtrAvidin反应

1. 参照前述操作，待玻片晾干后甩干多余液体并小心擦拭。
2. 将ExtrAvidin过氧化物酶或ExtrAvidin碱性磷酸酶稀释至最佳浓度。
3. 每张玻片上加入100ul，覆盖整个组织切片。
4. 将玻片向两个不同的方向进行倾斜。
5. 在加湿室内室温孵育至少20分钟。
6. 用洗瓶进行温和的PBS润洗。
7. 将玻片浸泡在PBS中5分钟。
8. 跳转至底物制备和显色反应步骤。

选择2 – 酶标二抗

1. 参照前述操作，待玻片晾干后轻轻甩干多余液体，小心擦拭玻片。
2. 将过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联二抗稀释至最佳浓度。
3. 每张玻片上加入100ul，覆盖整个组织切片。
4. 将玻片向两个不同的方向进行倾斜。
5. 室温或在加湿室内37 °C孵育30分钟。
6. 用洗瓶进行温和的PBS润洗。
7. 将玻片浸泡在PBS中5分钟。

底物制备

建议在最终洗涤步骤时进行底物混合物的制备。

注意：加入1mM左咪唑（货号L9756）至碱性磷酸酶底物溶液将会显著抑制内源性碱性磷酸酶活性（肠同工酶除外）。

显色

1. 参照前述操作，待玻片晾干后甩干多余液体并小心擦拭。
2. 加入足量的新鲜制备底物混合物以覆盖组织切片。
3. 孵育5-10分钟，或直至通过显微镜可以观察到期望的显色反应。在阴性对照出现背景染色前用洗瓶进行温和的润洗以终止反应。

复染

注意：使用AEC底物时，不要使用含有酒精的溶液进行复染（如哈式苏木精，酸性酒精），因为通过该方法产生的AEC染色可溶于有机溶剂。禁止对玻片进行脱水处理，重新加入到甲苯（或二甲苯）中，或使用含甲苯的封片剂进行封片。

1. 加入足量的梅氏苏木精以覆盖切片或将玻片浸泡在梅氏苏木精中。
2. 根据所用的苏木精强度孵育0.5-5分钟。
3. 用洗瓶进行温和的去离子水润洗。
4. 用自来水润洗玻片5分钟（避免直接冲洗以造成松散区域脱落）。
5. 采用甘油明胶等水相封片剂进行封片。可采用指甲油进行盖玻片密封。