建立胆固醇氧化酶酶促测定的标准化操作流程。
本操作流程适用于所有测定胆固醇氧化酶促活性参数的产品。本测定法不适用于测定来自裂褶菌(Schizophyllum commune)(已停产的货号C7274)和短杆菌属(Brevibacterium sp.)(已停产的货号C8153)。
胆固醇 + O2 胆固醇氧化酶 > H2O2 + 4-胆甾烯-3-酮
H2O2 + 邻联茴香胺(还原型) POD > 2 H2O + 邻联茴香胺(氧化型)
分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。
有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据说明书(SDS)。
T = 25°C,pH = 7.5,A500nm,光程= 1 cm
连续光谱法速率测定
2.涡旋彻底混合,然后在25 °C下用0.1 M HCl或KOH调节至pH7.5(如果需要的话)。加入试剂7.3.1至50 mL终体积,涡旋充分混合,并在使用前充氧约10分钟。
3.将下列试剂(毫升)移入合适的比色皿中:
4.倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至25 °C。监测A500nM恒定之前的状态。然后添加:
立即通过倒置混合,并记录约5分钟内A500nm的增量。利用试样和空白样的最大线性速率获取ΔA500nm/min结果。
在pH7.5、25℃下,一单位每分钟可将1.0 μmol胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮。
注意:4-胆甾烯-3-酮可能会发生异构化。
在3.0 mL反应混合物中,终浓度为46 mM磷酸钾、0.009%邻联茴香胺、0.017%(w/v)胆固醇、0.33%(v/v)Triton X-100、10单位过氧化物酶和0.01 - 0.02单位胆固醇氧化酶。
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