96孔3D球体BME细胞侵袭检测方法以标准化、三维、高含量的形式,在体外对侵袭细胞响应化学引诱物和/或抑制化合物而穿透屏障(包括基底膜组分)的程度进行定量,这一过程也是血管生成1、胚胎发育2、免疫反应3、和肿瘤细胞转移4的基础。内皮细胞、上皮细胞、肌肉和神经元细胞与其相邻基质之间形成的连续的胞外基质层称为基底膜。它们不仅支撑着细胞和细胞层,还通过影响细胞粘附、迁移、增殖和分化对组织形成产生重要作用。基底膜在发育和伤口修复过程中被降解和再生,并且它们是转移性肿瘤细胞侵袭的主要屏障。目前最常用的通过基底膜屏障来评估细胞侵袭的方法是Boyden室方法,例如Cultrex®BME细胞侵袭检测。该方法的确是一种快速、简便和定量的方法。然而,在显微镜下观察侵袭是非常困难的,并且该测定以单细胞悬液开始,其可能忽略掉转移过程中的早期步骤,例如初始上皮至间充质转换(EMT)。
对更完整和在生理条件下预测癌症侵袭模型的需求推动了96孔3D球体BME细胞侵袭检测的发展。越来越多的证据表明,肿瘤细胞聚集体或球状体更能代表体内肿瘤,它们具有多种生理特征,包括相似的形态、细胞-细胞键的形成、增殖率降低、细胞存活率增加、肿瘤休眠以及一个缺氧的核心5-8。将该模型应用于3D培养物侵袭检测中,提供了用于评估肿瘤侵袭的更生理学的方法,并提供了可通过图像进行分析定量的视觉组分。
该96孔3D球体BME细胞侵袭检测试剂盒利用符合3D培养要求的96孔球状体形成平板以及专门的球状体形成ECM来促进细胞的聚集和球状体形成。在球状体形成完成后,球状体嵌入由基底膜蛋白组成的侵袭基质中。该基质形成水凝胶网络,侵袭的细胞可在其上行进。此时,可以将入侵调节剂应用于系统中以评估其对细胞反应的影响。细胞侵袭的过程可在显微镜下进行可视化,并可通过图像分析软件进行定量。
II.成分 |
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图 1.96孔3D球体BME细胞侵袭测定步骤
产品在手动除霜冰柜中–20 ⁰C条件下,自发货日期开始可稳定至少3个月。为获取最佳的稳定性,请将其储存在–80 ⁰C。避免反复冻融。
以下操作步骤应该在采用杀菌技术的生物学超净台中进行以防止污染。
A.细胞收集
根据制造商的建议进行细胞培养。建议采用以下程序并可能需要对其进行优化以适应所研究的细胞类型。
B. 96孔3D球体BME细胞侵袭测定步骤
图 2.3D侵袭分析过程 A) 捕获图像并转换成8字节;B) 设置阈值以捕获整体的结构;C) 选择结果以计算总面积。
1.Cultrex® 3D培养96孔BME侵袭检测提供细胞侵袭的形态学和定量分析。侵袭细胞从球状体突出到周围的基质中,形成纺锤状突起;然而,在没有侵袭基质的情况下未见突起(图3)。这导致侵袭细胞系在相对少量的时间内使表面积发生了大的变化,而这对于非侵袭性细胞系来说不会发生(图4)。可对这些表面积的变化进行测量并用于比较不同细胞系或经历基因操作的细胞系的相对侵袭能力。
图 3.四天内3D细胞侵袭的形态学分析。非侵袭性细胞(MCF-7)保持细胞聚集的状态并且不会侵袭周围的侵袭基质;然而,侵袭性细胞(MDA-MB-231)以纺锤状突起的形式侵入周围的侵袭基质。
图 4.四天内非侵袭性(MCF-7)和侵袭性(MDA-MB-231)细胞系表面积的定量分析。
2.表面积的变化也可用于评估药理学化合物对3D细胞侵袭的影响。一旦建立了最佳测定条件,就可以将其评估为终点测定。以下检测是通过采用不同浓度的抑制剂(萝卜硫素)对MDA-MB-231细胞进行处理而进行的。
a.首先,计算每种条件的面积,这些值用于生成平均值和标准偏差:
b.接下来,将没有侵袭基质的球状体面积用作背景值,并从每个条件的平均值中减去:
c.最后将产生的面积除以未作抑制剂对照处理获得的面积,以对照百分比的形式作为侵袭指数。
d.采用抑制剂曲线的线性部分进行IC50的计算(y=0.5时x的值)。
- 基于线性方程,x =(y - 1.0389)/ -0.0395。
- 因此IC50 =(0.5-1.0389)/ -0.0395 = 13.6μM 萝卜硫素
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