该程序描述了透明质酸酶活性的比浊测定法(600 nm 处的透光率 %,光程 =1 cm)。它基于以下反应:
透明质酸酶
透明质酸------------------>二糖和单糖 + 较小的透明质酸片段
单位定义:一个单位活性的透明质酸酶在 pH 5.35、37°C下、2.0 ml 反应混合物中(45 分钟测定)中将引起每分钟 0.330 的A600变化。
5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号74092)
0.5 M 磷酸氢二钠溶液(货号94046)
5.0 M氯化钠溶液(货号S6546)
牛血清白蛋白(货号A4503)
醋酸钠(货号S8625)
乙酸(货号695092)
比色皿
注意事项——有关危害和安全操作规范的信息,请参阅安全数据表。
使用超纯水(25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。
磷酸盐缓冲液(300 mM 磷酸钠,pH 5.35,37°C)——使用 5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号74092)在超纯水中配制 1:16.7 稀释液。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。
透明质酸溶液 [0.03% (w/v)]
酶稀释剂 [20 mM 磷酸钠与 77 mM 氯化钠和 0.01% (w/v) 牛血清白蛋白,pH 7.0,37°C] - 制备 200 mL:
酸性白蛋白溶液 [24 mM 乙酸钠,79 mM 乙酸,含 0.1% (w/v) 牛血清白蛋白,25°C,pH 3.75] – 制备 150 mL:
酶液(透明质酸酶)——临用前,用冷酶稀释液配制 1000 单位/mL 酶原液。用冷酶稀释液稀释酶原液,得到 ~6 单位/mL 的工作液。
最终测定浓度——在 2.0 mL 反应混合物中,最终浓度为 0.015% (w/v) 透明质酸、150 mM 磷酸钠和 2-5 单位透明质酸酶。
注意:将所有试样和空白错开至少 30 秒,以便在室温孵育之前有足够的时间倒置混合每份试样和空白。
1.将下列试剂移至合适的容器中:
2.涡旋混合并平衡至 37°C,保持 10 分钟。然后添加:
3.立即涡旋混匀,37°C 培养 45 分钟整。
4.45 分钟后,各试样和空白取 0.5ml 转移到含有 2.5ml 酸性白蛋白溶液的合适比色皿中
并立即倒置混匀。
5.让每个比色皿在室温下静置 10 分钟。
注意:如果孵育时间不是 10 min,结果会发生显著变化。
6.测定 600 nm 处的 % 透射率。
计算
1.
(%T 试样 – %T 空白) (df)
单位/mL 酶 = -----------------------------------------------
(14.84) (ml 酶溶液)
其中
df = 酶的稀释因子
14.84=Sigma-Aldrich 测定的消光系数
ml 酶溶液 = 反应所用酶溶液的体积
2.
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