磷酸化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。蛋白质激酶催化带负电荷的γ-磷酸基团从ATP转移到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基侧链,从而改变蛋白质的构象和活性。逆反应则由蛋白质磷酸酶完成,即从蛋白质中除去磷酸盐,亦称为去磷酸化。百分之三到四的哺乳动物蛋白质是激酶和磷酸酶1,2,有些对少数靶蛋白具有特异性,而其他则广泛地作用于许多蛋白质。
蛋白质磷酸化是控制蛋白质活性、相互作用、定位和降解的关键调节机制。它控制信号转导、细胞周期、细胞凋亡、代谢等过程。存在于典型哺乳动物细胞中的约三分之一的蛋白质被磷酸化,其中许多在多个位点上。丝氨酸磷酸化占磷酸化蛋白质组的86%,而苏氨酸和酪氨酸磷酸化分别为12%和2%。许多人类疾病与细胞蛋白质的异常磷酸化有关。3-5
细胞利用蛋白质的磷酸化 / 去磷酸化作为控制机制有许多优势。这种机制快速,不需要新蛋白质的合成或蛋白质的降解,并且是可逆反应。
当研究涉及蛋白质磷酸化的细胞过程(如信号级联和蛋白质-蛋白质相互作用)时,或者分析蛋白质上的磷酸化位点和磷蛋白质纯化时,必须通过磷酸酶抑制剂抑制细胞蛋白质磷酸酶。这样能够在选定的时间点冻结靶蛋白的磷酸化状态。磷酸化数据库www.phosphosite.org报告了80,000个磷酸化位点。如果不使用磷酸酶抑制剂,它们中的大多数都无法检测。
蛋白质磷酸酶根据其底物特异性分为多个亚类(见表1)。
以下实验数据比较了新磷酸酶抑制剂混合物3与它所取代的磷酸酶抑制剂混合物1(货号 P2850)。数据显示两种混合物的活性相当。
值得一提的是,为了抑制多种磷酸酶并有效降低总磷酸酶活性,建议使用我们的两种磷酸酶抑制剂混合物,即磷酸酶抑制剂混合物2(货号P5726)和磷酸酶抑制剂混合物3(货号 P0044)。
使用放射性底物 32P-Ser 磷酸化酶 A 在 pH 7.5、30 °C 下测量各种细胞和组织提取物中的内源性 PP1α 样活性。 在测定 PP1α 样活性前 5 分钟,在 30 °C 下将磷酸酶抑制剂混合物 1(货号 P2850)或磷酸酶抑制剂混合物 3(货号 P0044)加入提取物,至终浓度1%。图1中显示的活性是相对的而非绝对的。剩余的活性越小,放入反应中的混合物的抑制程度越大。
* 对于这些样品观察到的值太低,无法在图中看到,非常接近于零。
图 1.细胞和组织提取物中PP1α样活性的抑制
磷酸酶抑制剂混合物(货号P0044)是细胞和组织中蛋白质磷酸酶1α样活性的有效抑制剂。以下实验显示了其抑制效率,并将其与前一种磷酸酶抑制剂混合物1(货号P2850)。
人胎盘显示出每mg蛋白质的PP1α样活性比其他组织提取物高10-20倍。因此,选择它来显示磷酸酶抑制剂混合物的抑制效率。
使用放射性底物P-Ser磷酸化酶 A 在 pH 7.5、30 °C 下测量人胎盘提取物中的内源性 PP1α 样活性。 在测定 PP1α 样活性前 5 分钟,在 30 °C 下将不等量的磷酸酶抑制剂混合物 1(货号P2850)或磷酸酶抑制剂混合物 3(货号P0044)加入提取物。
使用pNPP底物在pH 10.4、37℃下,用比色测定法测量了牛肝提取物中的内源性AP样活性。测定 AP样活性前,在 30 °C 下将只含有磷酸酶抑制剂混合物3(货号P0044)或同时含有磷酸酶抑制剂混合物2(货号P5726)的提取物孵育 3 分钟,进行抑制反应。
如上所述,不同的抑制剂抑制不同的碱性磷酸酶同工酶。磷酸酶抑制剂混合物3(货号 P0044)强烈抑制牛肝提取物中存在的碱性磷酸酶的L-同种型,并且在添加了磷酸酶抑制剂混合物2(货号 P5726)(图3A)后表现出协同效应。
磷酸酶抑制剂混合物3(货号 P0044)对人体胎盘提取物中富含的具有碱性磷酸酶活性的P-同种型的抑制作用很小,因此通过使用磷酸酶抑制剂混合物2(货号 P5726(图3B)可实现抑制作用。
图3A和B. 对牛肝提取物中碱性磷酸酶(AP)样活性的剂量依赖性抑制
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