组织解离指南：胶原酶、分散酶和释放酶类型

有关我们组织解离酶的常规信息

• 针对我们胶原酶的描述
• 胶原酶产品
• 来自罗氏的胶原酶和Liberase^®酶
• 胶原酶测定
• 胶原酶组织消化/解离问题解决及参考文献

胶原酶是一种可分解将动物组织结合在一起的天然胶原的酶，由多种微生物和不同的动物细胞产生¹。最有效的胶原酶是由厌氧细菌溶组织梭状芽孢杆菌分泌的“粗制”胶原酶。我们最初采用的是MacLennan、Mandl和Howes²所开发的1953年发酵和纯化工艺，但最终通过改进得到了更高活性的产品。“粗制”胶原酶是指该材料是由胶原酶及其他几种不同酶组成的混合物，这些酶可共同作用以分解组织。现已知存在有两种形式的胶原酶^3,4。除少数例外，所有市售的不同胶原酶均是由溶组织梭状芽胞杆菌产生，或者是通过在大肠杆菌中表达克隆自溶组织梭状芽胞杆菌基因的重组形成而产生的。

针对我们胶原酶的描述

下表中的不同胶原酶产品，因其可分别对某些类型的组织（肌肉、胰腺、心脏、脂肪）相比其他组织进行更好地消化而被开发。除了满足酶活性指标外，我们每批次的胶原酶产品都必须通过对大鼠各种组织的消化测试。那些还标注了“经过细胞培养测试”的产品都通过哺乳动物细胞系进行了额外的测试，以验证其无细胞毒性。

以下也列举了从某些更为常用的胶原酶产品而制备的无菌过滤（0.2 mm）版本。

我们纯化的胶原酶产品仅含有痕量的酪蛋白酶（蛋白水解的）或梭菌蛋白酶活性。纯化的VII型胶原酶还可提供经过细胞培养测试以及无菌过滤的版本。

胶原酶产品 – 粗制胶原酶，色谱纯化，具有蛋白水解活性抑制剂的胶原酶及混合物

用于常规用途的粗制胶原酶

经使用测试的粗制胶原酶

色谱纯化的胶原酶

含有蛋白水解活性抑制剂的粗制胶原酶

Collagenase Blends™

这些产品的开发是为了实现胶原酶消化中更好的批次间可重复性。在混合物H和L中，纯化的胶原酶（混合物F）与纯化的梭菌中性蛋白酶的比例有所不同，从而为研究人员提供了更多的消化选择。

来自罗氏的胶原酶和Liberase^®酶

来自罗氏的胶原酶经过精心设计，能够可靠地为您的常规和关键应用提供一致的性能和可重复的结果。胶原酶适用于从多种类型的组织中进行细胞制备，如肝细胞、脂肪细胞、胰岛、上皮细胞、肌肉细胞和内皮细胞。然而，每个批次针对组织破碎的适用性应经过实证确定。此外，我们的Liberase^®酶技术将高度纯化的胶原酶I和II与Dispase^®或Thermolysin相结合，促进了多种组织类型的解离。

Liberase研究等级应用指南

分散酶

与罗氏所提供的酶一起，我们致力于提供高度纯化且可满足您特定应用需求的组织解离试剂。分散酶是一种不会破坏细胞膜的温和酶，适用于分离体外生长的各种组织和细胞，并防止悬浮培养的细胞结块。

胶原酶测定

纯化的I型和II型胶原酶针对天然胶原蛋白和合成型底物具有不同的特异性和相对活性。这两种胶原酶的主要区别在于它们对于用于我们测定的两种不同底物的不同偏好性。胶原酶消化单位（CDU）测定¹¹主要测定的是胶原酶I的活性，其可切割长链未变性胶原蛋白中的三个螺旋链中的两个。胶原酶II的活性是通过该酶在第二种胶原酶消化测定中能够切割短链合成肽N- [3-（2-呋喃基）丙烯酰基）-Leu-Gly-Pro-Ala（FALGPA，参见产品编号F5135）而进行测定的^12,13。与两种形式的该酶混合物相比，纯化的胶原酶I或II制品在消化各种类型的胶原蛋白或哺乳动物组织方面显示出了更低的效率。仅含有胶原酶I和II形式的纯化胶原酶在消化组织方面不如完整的粗制胶原酶或纯化胶原酶以及各种蛋白酶的组合有效。显然，真正的胶原酶与自然进化出的不同天然蛋白酶、梭菌蛋白酶和氨基肽酶的组合在消化不同动物组织中的胶原蛋白时能够相互促进。粗制胶原酶产品对于组织消化总是最有效的。一些研究人员已经尝试将色谱纯化的胶原酶与诸如胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶等蛋白酶进行混合以用于消化组织。

除了用于胶原酶活性的CDU和FALGPA测定外，我们还检测了每个产品批次中酪蛋白酶^14,15、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶的活性，以了解胶原酶产品中蛋白水解酶的活性。在对可促进动物组织消化的三种蛋白水解活性进行测量中，酪蛋白酶测定是最为重要的。由于粗制胶原酶中存在的梭菌蛋白酶必须是经过还原（如通过用二硫苏糖醇处理）以使其具有活性，因此该酶可能对在实验室中进行的组织解离过程几乎没有贡献。它是因为一些研究人员报告了梭菌蛋白酶可能具有破坏性或毒性而被监测的。

许多满足酶促指标要求的胶原酶产品也经过了多种大鼠组织的使用测试。对不同批次的II型（C6885、C1764）和VIII型（C2139）胶原酶从大鼠附睾脂肪垫释放脂肪细胞的能力进行了测试⁵。然后通过测量添加和不添加胰岛素的葡萄糖氧化速率而对脂肪细胞的代谢活性进行筛选。已对不同批次的IV型（C5138、C1889）和VIII型（C2139）从大鼠肝脏释放活细胞的能力进行了测试⁷。不同批次的V型（C9263、C2014）、XI型（C7657、C4785、C9407和C9697）以及S型（C6079）胶原酶必须通过从大鼠胰脏释放完整胰岛的产品测试⁸。

胶原酶组织消化/解离问题解决及参考文献

基于我们自己的研发，并从与客户的讨论中可以清楚地看出，特定组织的解剖和制备方式对任何组织消化——胶原酶解离的速度和效率都有显著影响。组织供体年龄的差异也可能是长期范围内的主要变化来源。确保钙离子以 5 mM 存在于消化缓冲液中。螯合剂 EGTA 和 EDTA 可通过去除酶稳定性和活性所需的钙离子而严重抑制胶原酶活性。其他抑制物质还有β-巯基乙醇¹⁶、半胱氨酸¹⁶和 8-羟基喹啉-5-磺酸盐¹⁶。新一批具有较高比活性的胶原酶在一定浓度下可引起细胞过度死亡。在这种情况下，应使用较少的胶原酶和/或添加BSA或血清（分别高达 0.5% 和 5-10%）来稳定细胞已实现进一步的消化。

* “混合物”产品（编号C7926、C8051或C8176）中单独制备的胶原酶和蛋白酶可为每种试剂的用量提供可重复的控制。

** 过度搅拌的剪切力会使DNA酶失活，添加的酶可能被胶原酶中存在的中性蛋白酶消化。

*** 使用 EGTA（或 EDTA）去除Ca++并冲走微生物，然后用缓冲液清洗组织以去除螯合剂。酶溶液中不要加入EGTA或EDTA！