裂解和蛋白提取

有许多方法可用于破坏细胞并制备其内容物以进行分析。一般来说，当样品由易于裂解的培养细胞或血细胞组成时，可采用温和的方法，而对于较坚固的细菌或植物细胞，或嵌入结缔组织中的哺乳动物细胞，则可采用较强力的方法进行破坏。

• 基于洗涤剂的裂解：洗涤剂裂解：洗涤剂裂解是一种温和的方法，可用于哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌和植物。将细胞悬浮液轻轻离心，然后重新悬浮在含有去垢剂的裂解液中，去垢剂会破坏细胞膜。细胞膜被溶解，细胞裂解并释放其内容物。如果洗涤剂干扰分析或生产，则需要在下游将其去除。
• 冻融裂解： 这种方法适用于哺乳动物或细菌细胞悬浮液。使用液氮快速冷冻细胞悬浮液。然后解冻样品，用移液管或轻微涡旋将其重新悬浮在裂解缓冲液中，重复此过程数次。在两次循环之间，对样本进行离心，保留含有可溶性蛋白质的上清液。
• 渗透休克：这是一种非常温和的方法，无需使用洗涤剂即可裂解悬浮的哺乳动物或细菌细胞。这种方法通常与机械破坏相结合，依赖于从高渗透介质到低渗透介质的变化，非常适合裂解液随后要分馏成亚细胞成分的应用。
• 超声波处理：这种蛋白质提取方法最常用于细胞悬浮液。通过插入样品中的探针，高频声波会破坏细胞。声波产生一个低压区域，导致细胞膜破坏。
• 机械方法：可以使用各种粗糙但有效的粉碎和研磨方法从细胞和组织中提取蛋白质。例如，可使用 Dounce 或 Potter-Elvehjem 均质法通过液体剪切力破坏细胞膜。使用 Waring 搅拌器或 Polytron® 匀浆器在冷冻缓冲液中切碎或碾碎组织。可将组织或细胞冷冻在液氮中，然后用带氧化铝或沙子的研钵和研杵研磨成细粉。用细玻璃珠快速搅拌细胞，破坏细胞壁，对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效。
• 酶解：酶解法：从细菌、酵母或嵌入纤维组织的真核细胞中提取蛋白质时，经常使用酶解方法，因为细胞膜周围有坚固的保护结构。细胞裂解酶或混合酶，如溶菌酶、褐溶酶、MetaPolyzyme、Lysonase 和 Pronase，可与组织消化酶（如胶原酶、软骨素酶、透明质酸酶）结合使用，以溶解或破坏细胞壁、包膜、胶囊、囊壳或其他仅靠机械方法不易剪切的结构。酶解后可在裂解缓冲液中进行均质、超声或剧烈涡旋。

此外，由于内源性蛋白酶和磷酸酶可能会在细胞破坏时释放出来并降解目标分子，因此在细胞破坏和随后的纯化过程中应使用 蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以避免目标失控。