用于细胞荧光标记的PKH linker试剂盒

用于细胞荧光标记的PKH linker试剂盒

特点

• 可对活细胞进行稳定、均匀、强烈和可再现的荧光标记。
• 稳定标记长达100天
• 无细胞毒性，对生物活性或增殖活性无影响
• 染色强烈且易于使用
• 多功能 — 适用于任何细胞类型
• 从细胞到细胞的泄漏或转移最小

简介

细胞功能和发病机制的许多关键研究成果都依赖于标记活细胞。为了研究个体细胞行为、生长和分化以及细胞间的相互作用，能够永久地“标记”细胞群而不影响其形态或功能是至关重要的。对细胞现象的研究，例如粘附、结合物形成、细胞毒性、吞噬作用、生长促进、存活时间、细胞凋亡和杂交瘤融合等，都依赖于可靠、无毒、稳定的细胞标记。

用于标记细胞的早期方法使用荧光标记（例如荧光素、罗丹明、Dil-C₁₈-(3)或Hoechst染料）或者放射性标记（例如¹²⁵I-碘苷、¹¹¹In-铟喔星和⁵¹Cr-铬酸钠）。这些方法在它们各自的时代都发挥了很好的作用，但也都有各自的局限性和缺点。¹ 有些方法不够稳定，因此它们会泄漏并转移到混合群体中的其他细胞，这会产生混淆的结果。有些方法则改变细胞功能或具有细胞毒性，因此导致与其使用直接相关的实验伪影。最后，这些方法所实现的标记通常弱或不均匀，使得检测困难并且不可能设计可靠的标记方案。

PKH荧光细胞接头试剂盒避免了这些传统方法的所有缺陷。现在有了一种细胞标记方法，它是唯一一种“最佳方法”，可以持续可靠地标记活细胞（表1）。PKH染料以其发现者Paul Karl Horan的名字命名，是获得专利的荧光染料和细胞标记技术²，已成功用于动物、植物和细菌细胞，甚至可以染色含有非细胞膜的颗粒。³ 标记的细胞可通过培养以及在体内进行研究。快速分裂的细胞（例如杂交瘤）以及非增殖细胞（例如红细胞）亦可被标记和跟踪。 

多功能性

PKH细胞标记技术的多功能性归功于其创新化学。强荧光染料基团与长的亲脂性尾部相连。在短的一般膜染色过程中 — 仅1-5分钟 — 亲脂性尾部扩散到细胞膜中，使荧光基团暴露在细胞外表面附近。

采样后四周

将这些分子稳定地分配到膜中，可允许长期监测，同时使重要的功能性表面蛋白质保持不变。事实上，从增殖到细胞表面抗原识别的所有细胞功能在很大程度上不受PKH染料标记的影响。简而言之，被标记的细胞就像未标记的细胞一样，只是更容易跟踪。

强烈、可再现的膜染色

PKH染料标记方案通常可以优化，以提供超过75％的活标记细胞，平均荧光强度超过背景1,000倍（图1）。当标记增殖细胞系时，这种高信噪比尤其重要，因为每个子细胞仅能获得其亲本细胞标记的一半。使用PKH染料，在标记强度降低到接近背景强度之前，可以跟踪多达十代（图2）。

PKH染料的特性

有三种不同的PKH染料可用于标记细胞 - PKH2、PKH26和PKH67。PKH2和PKH67是绿色荧光标记，两者均可用显微镜和配有荧光素过滤器的流式细胞仪检测。由于它们的发射光谱与红色区域几乎没有重叠，因此它们非常适用于细胞毒性研究^4,5，与红色荧光活力探针如碘化丙啶（PI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）以及其他红色标记如R-藻红素和德克萨斯红结合使用。它们也非常适合植物研究，因为它们避免了红色区域叶绿素自发荧光的干扰。

PKH2的体内半衰期为5-8天，因此非常适合中短期研究。PKH67具有比PKH2更长的脂肪族尾部，产生更稳定的标记和更少的细胞间转移6。其体内半衰期为10-12天。PKH2的先前使用者可能会发现，在中长期研究中以及在必须最小化细胞间转移的研究中，PKH67能产生更好的结果。

PKH26是一种红色荧光染料。它具有最长的体内半衰期 — 超过100天 — 这使其特别适用于体内细胞跟踪、细胞增殖研究和其他长期测定。^7-9 罗丹明或藻红蛋白（PE）过滤器适用于PKH26检测。可以使用标准荧光素激发波长，但荧光强度会稍微降低。

PKH26与绿色PKH染料互补。在混合细胞群的研究中，它可以在不受PKH2、PKH67或荧光标记抗体干扰的情况下定量（图3）。

方法

对一般细胞标记

体外一般细胞标记程序可用于悬浮的单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和其他细胞。在组织培养容器表面上生长的细胞可以原位染色，但可能导致染色不均匀。为了获得均匀染色，应首先通过蛋白水解处理（例如胰蛋白酶 + EDTA）使贴壁细胞悬浮。

图4是实验方案的示意图。在试剂盒随附的PKH稀释剂中，将23细胞悬浮液和23染料溶液混合，在室温下短暂孵育。通过添加蛋白质（含有血清或BSA的培养基）终止标记反应。将标记的细胞洗涤3-5次以除去未结合的染料。一般细胞标记应在单克隆抗体染色之前进行，以免染料盖住抗体。

对吞噬细胞标记

使用替代稀释剂，可以在非吞噬细胞的存在下选择性地标记吞噬细胞。在这种稀释剂中，染料不会溶解，而是形成微团聚体；这些微团聚体不能嵌入膜中，但可以通过吞噬作用被摄取。这种方法已用于研究体内巨噬细胞和中性粒细胞的寿命和迁移模式。

为了基于染料稀释曲线分析增殖，我们推荐Modfit软件（缅因州Topsham市的Verity Software House）中的增殖向导模块。

总结

PKH荧光细胞接头试剂盒使用获得专利的荧光细胞接头技术将报告分子结合到细胞膜中。标记细胞同时保留了生物活性和增殖活性，是细胞追踪和细胞间相互作用研究的理想选择。由于染料的非特异性标记功能，已成功标记了多种细胞类型。接头已应用于动物和植物细胞。表2列出了已成功标记的常见细胞类型，表3列出了许多PKH染料应用。