聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种基础技术,基于电泳迁移率分离蛋白质和其他大分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联分子聚合而成。丙烯酰胺和双丙烯酰胺共同形成孔隙,而蛋白质可以通过这些孔隙迁移。
聚丙烯酰胺凝胶由两部分组成:浓缩胶和分离胶。浓缩胶部分含有低百分比的丙烯酰胺,用于将样品浓缩成单一条带,然后进入分离胶。分离胶含有高百分比的丙烯酰胺,可按大小分离蛋白质。丙烯酰胺浓度与孔隙尺寸线性相关;丙烯酰胺浓度越高,凝胶内的孔隙就越小。小孔隙适合分离低分子量蛋白质。
PAGE使用不连续缓冲体系,其中的凝胶缓冲离子与电泳缓冲离子不同。这两种离子电泳迁移率的差异,导致蛋白质通过时形成动态电压梯度。Tris-Glycine凝胶是最常用的PAGE系统,采用由Tris-HCl组成的凝胶以及由Tris碱和甘氨酸组成的电泳缓冲液。Tris-Glycine凝胶在高碱性环境下工作,可能引起非必要的蛋白质变性,如脱氨和烷基化。因此,在Tris-Glycine凝胶中,蛋白质条带可能会扭曲或分辨率下降。
而Bis-Tris凝胶的凝胶缓冲液使用Bis-Tris和HCl,电泳缓冲液使用MOPS或MES。Bis-Tris凝胶在中性pH下工作,可最大限度减少蛋白质改性,提升凝胶电泳期间的蛋白质稳定性。这也进一步提升了蛋白质条带的分离度和准确度。Bis-Tris凝胶的保质期也比Tris-Glycine凝胶更长——后者会随时间推移开始水解。Bis-Tris凝胶可与MOPS或MES电泳缓冲液灵活搭配;两种离子的迁移率差异导致分离的蛋白质范围不同。MES适合分离小分子蛋白(<50 kDa),而MOPS适合分离中大分子蛋白质。
在蛋白质制备过程中,考虑样品缓冲液的类型也很重要。在Tris-Glycine凝胶中,Laemmli缓冲液通常用于在带负电荷的SDS离子中进行蛋白质变性和包埋。接着将样品在100℃下煮沸,以促进其变性。加热Laemmli缓冲液至100 °C会使pH变为强酸性,这种热和酸性的结合经证可能导致Asp-Pro肽键上的蛋白质优先裂解(Rittenhouse和Marcus, 1984)。这在电泳过程中会产生明显的蛋白质降解产物。而Bis-Tris凝胶使用LDS样品缓冲液,在样品制备过程中保持碱性pH,不需要加热到70℃以上就能使蛋白质完全变性。该制剂可最大限度避免切割Asp-Pro肽键,维持蛋白质的完整性。
图 1.Tris-Glycine(左侧)和Bis-Tris(右侧)凝胶的对比。手动灌制12%浓度的Tris-Glycine和Bis-Tris丙烯酰胺凝胶,隔夜聚合。凝胶加入相同的大肠杆菌裂解产物滴定液(泳道3-6)、mPAGE®未染色蛋白质标准品(泳道2和7)以及mPAGE®彩色蛋白质标准品(泳道1)。分别在Tris-Glycine或MOPS电泳缓冲液中跑胶,用ReadyBlue™蛋白凝胶染色1小时,用去离子水脱色1小时。
尽管市面上可以购买到专用的预制聚丙烯酰胺凝胶(例如可分析不同大小蛋白质的在丙烯酰胺梯度凝胶),但许多研究人员仍可能选择手动灌制聚丙烯酰胺凝胶。手动灌制聚丙烯酰胺凝胶比预制胶便宜;但试剂和灌注设备的准备工作繁琐而耗时。凝胶缓冲液制备过程中的人为差异也会导致凝胶性能和质量参差不齐。
mPAGE® TurboMix Bis-Tris制胶试剂盒提供了预混缓冲液和丙烯酰胺溶液,根除了手动灌注凝胶人为差异和耗时的顽疾。试剂盒包括20%丙烯酰胺分离胶溶液,可配制丙烯酰胺凝胶的分离胶部分。分离溶液可以用去离子水稀释至所需的丙烯酰胺百分比,范围为8% - 15%。试剂盒包括4%丙烯酰胺浓缩胶溶液,用于形成丙烯酰胺凝胶的浓缩胶部分。这些预配溶液支持快速灌注,在灌注分离胶和浓缩胶之间无需等待聚合。以下是演示视频和简单方案。
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