PCR技术指南

本部分包含基本PCR / qPCR / dPCR实验方案实例，可用作探索本指南理论章节所述某些概念的基础。除了提供更一般的实验方案为适应特定的基于PCR的研究奠定良好的实践基础外，还包括用于检测方法质量控制的详细实验方案。

实验设计

生物数据的科学分析集中在假设的形成和检验上。假设的制定需要详细了解实验的条件以及变量。对一个假设的成功检验包括谨慎的执行和合适的实验设计，在最小化技术变异性的同时最大化所需的观察信号。

解决技术性误差的一种方法是在分析中使用重复实验。通过使用样本重复进行实验检测，可以对得到的检测结果进行平均，以得出更可靠且不易受随机技术误差影响的观测估算值。重复也用于估测技术处理所引入的误差。在嵌套的实验设计中，可在几个技术处理步骤中分别设置重复，以创建重复实验的树结构。因此，嵌套的实验设计允许对技术误差的每个组成部分的贡献进行详细分析，并通过对最终结果的重复实验进行平均来提高结果的精度^1,2。

较高数量的重复可增加通过求平均来降低整体技术性误差的可能性。这可以通过将模拟案例的置信区间与标准化误差进行比较来说明。置信区间基于给定的置信水平（通常为95％）估计平均值，并且通常假设误差由统一的标准偏差表征（1）。在只有两次重复的情况下，在这些条件下的置信区间是8.99，表明间隔很宽，因此对真实均值的位置估计不佳。通过三次重复，置信区间可大幅减少3倍以上至2.48。随着重复次数的进一步法增加，置信区间继续减少（5次重复时为1.24，10次重复时为0.72，依此类推）。然而，正如我们所看到的，置信区间的最显着降低发生在较低数量的重复，例如从两个重复增加到三个重复的过程。减少技术误差对于确定最终结果的统计显着性具有重要意义。因此，如果可能的话，建议设置三次或更多重复对样品进行分析。

解决技术性误差的另一种方法是使用参考基因进行标准化。使用参考基因的基本思想是假设它们将遵循并经历与作为研究对象的基因相同的技术处理。此外，假设参考基因的表达在所研究的各种样品中是保持稳定的。当这些假设有效时，通过检测参考基因表达可用于标准化不同样品中的基因表达，从而减少技术误差对最终结果的潜在影响。然而，这些假设并不总是有效的，因此，对于每个特定的实验设计，必须仔细验证参考基因。

统计分析的关键是抽样。抽样意味着从每个组别或群体中获得有限数量的样本，但这些样本被用于得出关于完整群体的结论。因此，样本必须能够代表整个群体。从整个群体中进行随机抽样是十分重要的。

以一个有具体问题的研究人员的事例来进行说明。该研究人员想测试不同药物对小鼠特定基因表达的影响。问题是无论他测试的是哪种药物，他总是看到基因表达的显着差异。但这似乎不太现实，因此他聘请了一位生物统计学家，并很快注意到阴性对照小鼠总是在实验室后角的笼子里饲养，而药物治疗的小鼠总是实验室窗户附近的笼子里饲养。这一例子说明小鼠不是从实验室空间中随机取样的，因此观察到的效果是由于非期望的系统取样偏差，而不是由于真正的治疗效果。

与技术重复相反，生物样本在进行数据分析时不是通过平均以减少误差，而是直接进行统计分析。生物样本的数量决定了可以实现的显著性水平。例如，在5％的显著性限制下，我们期望在纯随机样品中每20次测试有一次具有显著性。为了对接近显着性限制的样品进行排序，有必要测试至少20个生物样品。此外，为了以足够的精度确定显著性，建议记录至少50倍生物样本数量的数据³。当生物体是生物样品时，达到这样水平的精确度通常是不经济的或不实际可行的。然而，该实验案例说明了使用大量生物样品的重要性。为了获得显着且有意义的结果，需要仔细考虑收集足够数量的具有代表性的生物样品。

进行预实验是评估必要生物样本数量的好方法。在整个技术处理程序的不同阶段，预实验可能仅需使用有限数量的生物样本和一些技术重复。通过使用有限数量的样品和重复进行预实验，可以更经济地进行预实验并为随后的全面研究建立最佳的参数。进行预实验不仅可以确定所需的生物样本数量（基于所评估的数据的固有误差和生物反应信号的幅度），而且还可以确定，例如，技术处理程序中的哪个时刻会引入最多的技术误差（并在完整的研究中，针对这一阶段设置更多的技术重复）；它还可以识别和验证适当的参考基因和合适的对照。

技术考虑因素

正确的实验操作对于所有基于PCR的技术都很重要。准确和仔细的样品处理和准备有助于减少从一个实验到下一个实验的携带污染，以及样品之间的交叉污染。以下指南有助于将污染的可能性降至最低：

• 选择最合适的手套⁴。
  
• 经常更换手套。
• 使用专用移液器专门用于混合物制备和核酸处理。
• 使用带有护圈和气溶胶屏障的移液器吸头。
• 使用无菌、无核酸酶的水和专用试剂（每次实验使用一个等分试样）。
• 使用带螺旋盖的小管进行稀释和反应预混液配置。
• 使用漂白剂或类似清洁剂的稀释溶液擦拭所有工作台。
  
• 在带紫外线灯罩的干净工作台上准备样品。
  
• 将热循环仪区域远离样品制备准备区域。
• 在冰上解冻所有试剂（除非另有说明）并在使用前仔细混合并离心。
• 准备足以用于所有样品的试剂预混液（准备额外的10％以确保有足够的材料，例如，如果需要包括对照在内10个样品，则按11个反应制备预混液）。
• 除非使用逆转录实验方案（一步法SYBR Green I染料检测法）和逆转录实验方案（一步法探针检测法）中所描述的逆转录实验方案，否则应确保cDNA是使用随机引物法或oligodT引物法产生的，并稀释，然后在PCR / qPCR中使用（参见标准逆转录实验方案（两步法））。

对照

忽略对样本有利的对照可能看起来是可以节约成本，但从长远来看，实验有效性会受到影响，并且很难进行故障排除。在任何实验中，合适的对照有两个主要目的：确保实验结果是检测所得的结果，并在实验失败时提供诊断数据。

“合适对照”的实际定义将因实验细节而有所不同。一些对照设置的建议包括：

• 阳性对照：已知含有目标靶序列的DNA或cDNA样品。如果扩增子短（<130个碱基），则与靶标匹配的人工寡核苷酸可用作阳性对照。
  
• 阴性对照：不含目标靶序列的DNA或cDNA样品。
  
• 水/污染对照或无模板对照NTC)：水或NTC是一种有效的对照，可添加至孔板中，作为模板反应潜在污染的监测。
  
• RT阴性对照：为了鉴定mRNA样品中的污染基因组DNA（gDNA），可将每种RNA样品在不含RT酶的RT反应混合物中进行孵育。

实验的最终结果仅在相应的对照也显示正确结果时才有效。

上样PCR / qPCR孔板

使用PCR孔板时，请按照平板示意图系统，确保将反应混合液、样品和对照添加至正确的孔中。简单地离心反应孔板或小管以将样品收集于底部，并在进行反应之前除去气泡。

关于是否首先将样品或反应混合液装入板中仍存在争议。由于意见分歧，如何选择可以按照个人偏好进行，但有几点需要牢记。

当首先加入预混液（包含除目标DNA之外的所有反应组分）时，样品孔到孔的交叉污染的可能性降低，并且可以安全地使用单个移液吸头。然而，大多数常规反应由含有2-5μDNA模板的15-25μL反应体系组成。这意味着当将模板添加至孔中时，几乎没有机会再次检查模板样品是否成功加入。一种解决方法是用干净的封板膜将孔板覆盖，然后刺穿封板膜以添加样品，因此在孔板加样期间可以对刺穿的孔进行跟踪。相反，如果在预混液之前将少量样品添加至孔中，则可以在视觉上验证每个孔中是否含有样品，并且体积是否正确。但是，在随后添加预混液之前，必须将样品收集到孔的底部，并且必须小心地添加预混液以防止携带模板污染。