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增强抗体验证

有助于确保抗体可重现性、特异性和性能的额外验证数据

EV图标

我们的增强抗体验证工作

增强抗体验证可为研究人员提供额外一层保障,确保抗体对靶标目标抗原的特异性与之前约定的表达数据一致。许多相关领域科学家纷纷要求商业化抗体提供更有力的验证证据,证明其与目标抗原特异性结合。为响应更严苛的抗体免疫检测验证需求,我们非常乐意针对自己的众多抗体产品提供增强验证。现在我们的产品页面上已经开始提供增强验证(EV)数据,产品目录中包含“EV”符号的抗体均提供此类数据。所有带有“EV”符号的抗体均提供通过一种或多种增强验证策略获得的数据。

现行商业抗体验证策略

商业抗体开发人员通常仅通过蛋白质免疫印迹(WB)或免疫组织化学(IHC)法,在免疫后筛选过程中评估抗体的靶向结合情况。此筛选方法可确保开发初始阶段的抗体可识别预期靶标,同时具有与之前的批次(如存在)相近的性能。但这种简单的筛选不足以确保实际应用适用性和真正的批次间一致性。

因此,我们又选择了与产品预期用途相关的样品,额外进行了尽可能广泛的免疫检测应用测试。此类测试包括免疫组化(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、蛋白质免疫印迹(WB)、ELISA、免疫沉淀等应用领域。这种深入的应用测试可帮助评估抗体对靶标的特异性,并针对客户最可能的应用和样品提供相应背景相关验证。这类特定应用数据由研究人员负责审查,并针对预期用途适当评估。在选择和使用抗体产品时,研究人员除了要审查供应商生成的应用数据外,还必须谨慎审核表位、物种反应性、克隆性、适当的宿主物种,并开发适当的对照物。

使用抗ATRX抗体进行蛋白质免疫印迹分析

使用抗ATRX抗体对人细胞系A-549进行蛋白质免疫印迹分析。货号HPA001906

在人扁桃体组织中,使用抗桥粒黏蛋白抗体进行免疫组织化学法增强抗体验证。

在人扁桃体组织中,使用抗桥粒黏蛋白抗体进行免疫组织化学法增强抗体验证。在复层鳞状上皮(A)以及人扁桃体隐窝(C)内层的上皮细胞中观察到膜连接免疫反应性。采用阴性对照试剂(B、D)处理同一组织,结果无检出信号。

货号MABT118

重组表达抗体

使用重组单克隆抗体进行增强验证

在抗体结合服务供应商针对相关研究应用进行鉴定后,再由研究人员适当选择和优化,是确保抗体性能及由其结果可靠的必要条件。验证抗体时,必须证明其对靶标蛋白具有特异性、可重现性和高亲和力。

重组抗体特异性

非特异性抗体可能会将其他蛋白误检为靶标蛋白,且常与多种靶标结合。我们的重组抗体是一种全新的单克隆抗体。我们的重组抗体使用重组表达系统生产,可精确指定靶标抗体的DNA序列,并在工程改造的“重组”细胞中生产并专门纯化,可实现精确的特异性。

重组抗体的重现性和高亲和力

传统的动物源抗体存在潜在批次间差异,让生命科学研究面临着可重现性问题。生物体活体来源抗体存在的问题包括表达损失、宿主中重链和轻链表达变化、突变、需要频繁测试甚至重新克隆。重组抗体可指定自身的编码DNA序列,实现稳定且高度可重现的批次间一致性,避免动物源抗体固有的大部分问题。即,重组抗体可稳定供应且始终具备最优性能,不存在供应问题或动物源抗体常常不可避免的克隆偏差。与靶标蛋白结合的抗体可识别不同表位(线性或构象)或不同亚型的同一靶标。我们的重组抗体在抗体验证实验中可始终提供稳定、高亲和力的抗体性能。

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重组抗体可提供与传统多克隆和单克隆抗体相似的性能,且可通过重组技术和表达增强特异性和可重现性。(A) 使用1:100稀释的货号ZRB04338抗EGFR,11E19克隆ZooMAb®单克隆进行NIH/3T3细胞系免疫荧光分析,使用与Alexa Fluor® 488(绿色)偶联的山羊抗兔二抗染色。用鬼笔环肽(红色)标记肌动蛋白丝。用DAPI(蓝色)染色细胞核。该抗体可阳性染色质膜、细胞质。

遗传策略

遗传策略 - 通过敲除/敲低方法验证抗体特异性

预期结果:在敲除/敲除验证实验中,蛋白质免疫印迹(WB)条带减少或缺失。

我们的遗传策略验证旨在通过基因编辑或基因干扰方法,消除或降低靶标蛋白表达,进而将此类样品的抗体识别性能与野生型进行比较,验证蛋白质检测的特异性。随后对这些降低或消除了目标蛋白表达的改造细胞样品WB或ICC染色,评估抗体的特异性。然后将改造后的蛋白表达水平与经证表达目标蛋白的野生型样品进行比较。

通过CRISPR/Cas9 基因组编辑技术可创建永久切除某一基因或一组基因的细胞系,“敲除”相应蛋白质表达。在抗体验证领域,它有望成为一个强大的应用工具。简而言之,靶标“敲除”样品无抗体染色(预期靶标已被基因去除),而相应的野生型样会识别靶标。通过比较这两种类型样品,可评估非特异性程度。

也可利用RNA干扰 (RNAi) 技术“敲低”或抑制特定基因,降低蛋白表达。和基因敲除方法一样,需要将基因改造后的“敲低”样品与野生型样品进行比较。与基因敲除法不同,RNAi改造样品观察到的抗体反应性信号低于野生型样品,但通常不会彻底消失。

遗传验证

RNAi敲低遗传验证实例。在用对照siRNA和两种靶标特异性siRNA探针转染的A-549细胞中,使用抗ATRX抗体进行蛋白质免疫印迹分析。siRNA样品中的ATRX下调证实了抗体的特异性。

独立抗体验证

独立抗体验证 - 通过IHC或ICC,利用多种靶向同一靶标的抗体验证抗体特异性。

预期结果:所有抗体呈现相似的染色模式或实验结果。

在给定免疫应用中,使用针对同一靶标的其他抗体执行同一操作方案并获得相同结果,证明使用该抗体获得的结果的有效性。至少结合使用两种无重叠表位的抗体和一组样品(例如来自同一组织的切片)。这种方法可提供一种额外优势,可在验证的同时比较两种抗体的结合特性。

RNA-Seq正交验证

RNA-Seq正交验证 - 通过抗体依赖性方法和非抗体依赖性方法(RNA-seq)联用,验证抗体特异性。

预期结果:抗体染色强度与来自同一样本的RNA-seq数据一致。

在抗体验证过程中,正交验证方法指将免疫检测结果与非抗体依赖性方法进行比较,测定目标基因或蛋白质。

正交技术(RNA-seq)是一种针对给定样品的特定靶标,基于mRNA水平定量基因表达情况的方法。这种mRNA水平的表达量与蛋白质表达量相对应。在这一增强抗体验证支柱方法中,以柱状图形式显示高/低(5倍差异)表达水平组织的mRNA表达水平数据(通过RNA-seq获得)及同一样品的WB或IHC数据。其中展示的是mRNA表达水平和样品染色的直接比较:高表达=强染色;低表达=弱染色或无染色。

RNAseq正交验证。

amab90516-wb1
hpa012657-ihc-n

蛋白质免疫印迹(WB,左)和IHC(右)正交验证。选择已知RNA高/低表达的样品。左图:在与RNA-seq数据(右)相关的U-251MG(VIM高表达)和MCF-7(VIM 低表达)人类细胞系中,使用抗VIM抗体进行蛋白质免疫印迹分析(左)。
右图:在与RNA-seq数据相关的人类肾脏(左,PLA2R1高表达)和胰腺组织(右,PLA2R1低表达)中,使用抗PLA2R1抗体中进行免疫组织化学分析。

功能实验验证

功能实验验证 - 通过免疫检测实验诱导靶抗原表达和/或活性水平变化,验证抗体特异性。

预期结果:通过WB、ICC、IF和FS免疫检测改造后的抗原活性或表达水平。

通过实验操控,可轻松体外调节许多抗原的表达和活性水平。利用常用蛋白表达或生物活性调控技术,可通过检测目标蛋白质活性或表达水平变化确定抗体特异性。功能实验验证可提供有力的抗体特异性证据,是EV的重要支柱之一。

免疫荧光

免疫荧光

在功能实验验证部分,在EBSS培养基中培养HeLa细胞2小时,实验诱导HeLa细胞(A)显示自噬体染色,而未处理细胞(B)未显示自噬体染色。固定细胞并先后用低温甲醇和丙酮透化,然后用5 μg/mL的兔抗LC3B(货号 L7543,自噬体膜标记物)染色。该抗体使用山羊抗兔IgG-Cy3偶联物开发。

我们致力提供经过生命科学研究验证的抗体

我们是市场领先的一抗产品供应商,每天都有业内同行通过大量同行评审文献验证这些产品的性能。我们凭借行业领先的质控流程和应用测试,确保我们的抗体始终可为您提供所需的性能。除上述长期验证承诺之外,我们还在许多抗体试剂的开发过程引入更严苛的验证策略,不断拓展和改进我们的流程。我们通过Antibody Guarantee(抗体性能保证)计划确保产品质量——如果我们的抗体产品未发挥预期应用性能,可予退款或免费更换。

表达/过表达验证

表达/过表达验证 - 通过靶标抗体过表达验证抗体特异性。

预期结果:通过WB和IF免疫检测过表达的蛋白质

表达/过表达验证方法通过转染方法过表达靶标蛋白,从而验证抗体的特异性——尤其适合尚未表达蛋白的细胞系。将蛋白过表达条件与经证不表达目标蛋白质的野生型对照样品进行比较。随后通过WB或IF染色过表达改造细胞样品,评估抗体的特异性。

表达/过表达验证

靶标蛋白过表达增强验证
通过对细胞样品进行蛋白质免疫印迹分析,验证抗体
(兔源抗
ACY3抗体)
识别能力——其中的细胞样品经经过改造,可过表达靶标蛋白,而野生型样品(对照)未检测到染色。

免疫捕获与质谱(MS)联用验证

免疫捕获与质谱(MS)联用验证 - 联用抗体免疫捕获技术和MS分析,验证抗体特异性。

预期结果:MS分析确认抗体直接与靶标蛋白相互作用。免疫捕获技术利用免疫沉淀(IP)方法,从细胞裂解物中分离和捕获与靶标蛋白结合的抗体。随后通过MS分析确认抗体识别靶标蛋白肽序列,直接与靶标蛋白相互作用。

参考文献

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仅供研究使用。不可用于诊断流程。

除非产品规格中另有说明,否则任何抗体产品均仅供内部研究使用,不得用于任何其他目的——包括但不限于任何商业、诊断或治疗用途。我们的验证过程仅基于研究用途,并未确认或担保我们的抗体适用于本文未授权的任何用途。