如何在AAW™自动化检测工作站上实现MILLIPLEX®人源细胞因子/趋化因子/生长因子多重检测面板 A 的自动化
本操作规程阐述如何借助 AAW™ 自动化检测工作站，将 MILLIPLEX® 人源细胞因子/趋化因子/生长因子面板 A 的多重检测试验实现自动化。通过对该 MILLIPLEX® 方案进行自动化，AAW™ 系统可实现“上机即走、全程免干预”，提升通量，并相较于手工方法显著提高结果的可重复性。
下文提供了从材料准备到数据核验的完整指南，同时呈现自动化与手工两种工作流程，便于对照与评估。
MILLIPLEX® 人细胞因子多重检测 Panel A 自动化简介
MILLIPLEX®人细胞因子/趋化因子/生长因子 Panel A 可在 96 孔板单孔中，同时定量检测人血清、血浆、细胞培养上清及其他生物体液中多达 48 种免疫因子。
MILLIPLEX®多重检测采用基于微球的多重检测技术，可在由 Opentrons® 提供技术支持的模块化 AAW™ 工作站上实现自动化，并配合 BioTek® 洗板机与 Luminex® 检测系统完成检测。
MILLIPLEX® 人 Panel A 支持两种实验方案，其中两天法为标准品/样本在 2–8 °C 条件下过夜孵育，一天法为标准品/样本在室温条件下孵育 2 小时。
两种方案均可在 AAW™ 自动移液工作站上完全自动化运行，工作站配有专用程序：过夜实验第 1 天、过夜实验第 2 天、当日实验。自动化可简化梯度稀释、封板/揭板、板架振荡等操作，并最大限度减少人工干预。板外洗板（BioTek®洗板机）与过夜孵育（2–8 °C 恒温摇板器）为需要手动完成的步骤，其余实验操作均可在 AAW™ 工作站全自动完成。
以下章节将详细介绍自动化流程，包括试剂准备、程序上传、工作台布局及实验运行，并对自动化与手动操作的结果进行验证与对比。
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注：AAW™自动移液工作站——即用型检测平台可针对多种实验方案实现检测与样本制备的自动化。该系统整合机器人硬件及模块，支持 MILLIPLEX® 检测的自动化流程。即用型工作站配备 1 通道和 8 通道移液器、抓扳手、加热振荡模块、磁珠分离模块及工作台扩展组件，同时可访问 Millipore®实验方案库，使用标准 Millipore® 与 Sigma-Aldrich® 检测试剂盒及试剂，确保性能稳定可靠。
* 注：对于 MILLIPLEX® 人细胞因子 Panel A + B 组合套装，仅 Panel A 可通过本方案实现自动化，Panel B 仍需手动操作。
MILLIPLEX® 免疫检测试剂制备
全程使用琥珀色试管与黑色板盖进行避光保护，替代铝箔、不透明盖板等手动避光方式，以维持光敏试剂（如 MILLIPLEX® 微球、链霉亲和素 - 藻红蛋白）的稳定性，保证实验性能一致。
实验开始前，请按照 MILLIPLEX® 人细胞因子/趋化因子/生长因子 Panel A 试剂盒说明书制备试剂：
- 使所有试剂恢复至室温。
- 用去离子水将 10 倍浓缩洗涤液稀释为 1 倍工作液。
- 制备抗体包被微球（若为单独瓶装）。
- 冻干质控品（QC1、QC2）分别用 250 µL 去离子水复溶。
- 冻干标准品用 250 µL 去离子水复溶。
注：标准品的系列稀释将由机器人自动完成。
- 若实验涉及血清或血浆样本，用 1 mL 去离子水复溶血清基质。
可检测分析物（48重检测）：sCD40L, EGF, Eotaxin, FGF-2, Flt-3L, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GROα, IFNα2, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-22, IL-27, IP-10, MCP-1, MCP-3, M-CSF, MDC (CCL22), MIG, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, TGFα, TNFα, TNFβ, VEGF-A
血清与血浆样本处理
为保证样本完整性，样本冻融次数应控制在2 次及以内。样本制备操作请参照 MILLIPLEX® 试剂盒说明书。
注：若在多重检测中同时检测 RANTES 分析物，需手动将 RANTES 微球加入预混的47重微球（或37重微球）中；RANTES 微球与47重（或37重）混合微球为独立分装。若在血清/血浆中检测 RANTES，建议采用单重检测，且样本必须1:100 预稀释，因为未经稀释的血清/血浆中 RANTES 浓度极高。仅当检测非血清 / 血浆类样本时，才可将 RANTES 加入47重（或37重）混合微球中。
实验程序上传与 AAW™ 工作站设置
在 AAW™ 工作站上传或运行实验程序前，请务必仔细阅读用户手册及所有技术说明，确保操作安全、准确。
实验程序选择与上传
Millipore®实验方案库 中提供三种适用于 MILLIPLEX® 人细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子 Panel A 且已验证的试剂盒专用程序脚本：
- 过夜实验 —— 第 1 天程序：启动实验设置与过夜孵育
- 过夜实验 —— 第 2 天程序：完成检测孵育等后续处理
- 当日实验程序：无需过夜步骤，可在当日快速完成实验
从Millipore®实验方案库下载所需程序，将程序文件导入电脑端的 Opentrons® App，选择 “Send to Opentrons Flex” 发送至 AAW™ 工作站；若程序已加载，可通过触摸屏上的 “Start Set-up” 按钮直接启动。
工作站设置包含 5 个主要界面，同时显示在电脑与触摸屏上：
- 参数
- 硬件
- 实验器具
- 液体
- 时间轴
前四个界面用于指导仪器与实验配置，时间轴界面可在自动化程序运行期间提供详细的分步追踪与实时进度显示。
参数设置
在 AAW™ 工作站上设置实验程序参数，以优化检测流程，并适配不同样本类型、板条配置及操作需求。
在参数界面完成设置后，点击 “确认数值”。典型参数（随程序不同略有差异）如下：
*注：建议在使用实际试剂前，先运行空载程序熟悉工作站操作步骤并验证配置是否正确。空载运行时，试剂混匀与孵育步骤会缩短，吸头也会放回吸头盒，可安全、无差错地核对程序并验证装置设置。
硬件模块确认与安装
硬件模块的确认与安装流程，可确保所有移液装置、功能模块及配件均已正确安装，以适配 MILLIPLEX® 自动化实验方案。
安装两支液体处理移液装置与 AAW™ Flex 抓扳手，并通过工作站触摸屏或应用软件，将所有工作台硬件模块（废液桶、暂存区、加热振荡模块）固定在指定的工作台插槽中。
按指定工作台位置确认并安装各硬件模块：
安装并固定好所有模块后，在触摸屏/软件中确认每个模块的校准与连接状态。排除所有错误或不匹配问题后再继续操作。
硬件设置确认、程序参数设置完成后，即可进入下一章节所述的实验器具与试剂上样步骤。
注：使用 MILLIPLEX® 实验程序时，Opentrons Flex™ 加热振荡模块必须搭配B 型通用适配器，安装在工作台 D1 槽位，并在触摸屏/软件中显示为已激活状态。程序脚本默认将加热器设为室温（关闭加热），振荡速度设为 700 rpm，用于工作台内孵育。默认情况下，程序会自动打开和关闭振荡适配器卡扣，以固定检测板或允许取出进行洗板和读数。
如需人工干预，适配器的实验器具卡扣开关选项默认隐藏，可在触摸屏的实验器具列表视图（检测板 / Opentrons 加热振荡适配器，D1 槽位）中显示并操作。
实验器具准备、试剂上样与平台布局设置
实验器具准备
实验器具设置功能可在机器人工作台上选择并放置所有试管、微孔板、储液槽、吸头盒及功能模块，确保系统识别实验程序所需的各项物品位置。
按照 Opentrons® 软件或触摸屏提示，识别并准备所选实验程序所需的全部实验器具（见上文耗材部分）。将所有试管、微孔板、吸头盒及储液槽放置在指定位置，并通过实验器具位置检查确认放置正确。
注：开始运行前，必须按照触摸屏或 Opentrons® 软件中的分步说明，至少执行一次实验器具位置检查。空载运行时可使用空器具，正式实验时可使用已加试剂的器具进行检查。实验器具偏移值确认并应用到所选程序后，AAW™ 工作站会保存该参数，后续使用相同程序时无需重复检查，除非需要重新校准。
试剂上样
液体设置界面会根据触摸屏 / 软件及实验程序提示，显示每种试剂或样本的名称、体积和来源。所需试剂体积根据参数栏中输入的批次大小和样本数量自动计算。MILLIPLEX® 人 Panel A 试剂盒专用程序的实验器具布局与试剂上样详情见图 1–3。
图 1. 过夜实验 —— 第 1 天试剂布局示意图显示初始实验设置的试剂摆放位置。
A. 试管架：混合微球（琥珀色试管；置于试管架A1位）、血清基质（透明试管；置于试管架B1位）。若实验方案或样本类型有要求，可选用其他基质液。
B. 储液板：检测缓冲液加入第 1 孔。
C. 96 孔 V 型底试剂/工作板：标准品、质控品和样本由软件/触摸屏以颜色标识（如蓝色为标准品7，红色为QC1和QC2，绿色为样本）。机器人先将锥形管中的混合微球加入试剂/工作板第7列，再自动加样至检测板。
图2. 过夜实验 —— 第 2 天试剂布局本布局通过先将检测试剂转移至试剂/工作板，再由机器人加样至检测板，可最大程度节约珍贵的检测试剂。
A. 试管架：检测抗体（透明试管置于试管架A2位）、链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE，琥珀色试管置于试管架B2位），供机器人移液使用，相比直接使用储液槽可减少死体积浪费。
B. 储液板：xMAP® Sheath Fluid PLUS 加入A2和A3孔。
C. 96孔V型底试剂/工作板：初始为空。机器人先将检测抗体和 SAPE 从锥形管分配至工作板第 1、2 列，再由 8 通道移液头将试剂转移至最终检测板（位于 D1 槽位，图中未显示），可最大限度减少因储液槽试剂体积不足造成的浪费。
图3. 当日实验试剂布局示意图显示当日实验的试剂摆放位置。
A. 试管架：实验开始前，将所有必需试剂（微球、基质液、检测抗体、SAPE）分别放置在试管架的对应位置，简化无人值守操作并减少人工处理。
B. 储液板：将缓冲液（检测缓冲液、xMAP® Sheath Fluid PLUS）加入指定的储液孔。
C. 96孔V型底试剂/工作板：预加载标准品、质控品和样本。右侧指定孔位用于接收混合微球、检测抗体和 SAPE，供机器人依次加样，在确保高效转移的同时最大限度减少试剂用量。
工作台布局设置
按上述要求完成试剂制备与上样后，流程进入将各实验器具放置到工作台指定槽位，以便进行自动化检测。严谨的工作台设置有助于节约试剂、保证实验一致性，在试剂体积有限或操作复杂时尤为重要。启动实验程序前，请确认吸头盒放置位置，并通过触摸屏 / 软件中的实验器具位置检查功能核对各器具位置，具体可参照图4-6）。
图4. 过夜实验 —— 第 1 天工作台布局示意图展示过夜实验第 1 天程序的 AAW™ 工作站工作台配置，器具名称清晰标注，便于直观设置。各器具在指定槽位的摆放如下：
该配置可实现标准曲线与样本的自动化加样，用于过夜孵育流程，提升实验重复性并减少人工干预。
图5. 过夜实验 —— 第 2 天工作台布局本示意图展示过夜实验第 2 天自动化加样与检测步骤的工作站工作台配置，所有实验器具的位置与名称均清晰标注，便于直观设置与机器人流程运行。
工作台布局中配备黑色板盖，可为检测板提供必要的避光保护，替代铝箔包裹、铝膜封板或在透明封板上加盖黑盖等手动方式。该自动化步骤可确保在工作台内进行检测试剂孵育时实现稳定避光，有助于维持实验完整性并降低操作人员工作量。
图6. 当日实验工作台布局本示意图展示 AAW™ 工作站用于MILLIPLEX®当日自动化检测的工作台配置。
本实验方案可实现孵育与检测试剂加样全过程的无人值守自动化，仅需在中间洗板步骤时，将检测板暂时手动转移至工作台外的洗板机即可。
所有实验方案（过夜法与当日法）的工作台布局均包含预装试剂的实验器具、检测板及吸头盒，并可按照触摸屏与软件界面所示，自动完成孵育期间的盖板操作。确认试剂与器具上样及硬件配置无误后，即可立即启动实验程序，工作台位置提示准确，可保证流程连续稳定。这套基于 AAW™ 工作站的 MILLIPLEX® 人 Panel A 自动化检测流程，显著减少了手动操作与值守时间，可实现流程简化、结果稳定可靠的实验效果。
MILLIPLEX®人 Panel A 检测自动化运行
完成工作台设置与实验器具上样后，关闭机器人舱门，点击蓝色 “Run” 箭头启动实验，AAW™ 工作站将自动执行所选实验程序。
自动化实验流程概述
AAW™ 工作站自动完成所有关键的初始液体处理、标准曲线制备、样本转移、试剂加样（基质液、检测缓冲液、标准品、质控品、样本及微球）与板条设置，并自动完成盖板操作。无论是过夜方案还是当日方案，均大幅减少人工干预（约 20 分钟，视样本数量而定）。
- 过夜方案：机器人完成实验设置与手动封板后，用户可将检测板取出，在 2–8 °C 条件下振荡孵育过夜，全程无需值守。
- 当日方案：机器人完成所有设置、试剂转移与自动盖板后，可连续无人值守运行超过 2 小时 20 分钟，直至需要手动洗板。
孵育结束后，在工作台外使用BioTek®洗板机完成洗板。随后 AAW™ 工作站继续自动化加样（检测抗体与 SAPE），并自动完成开盖 / 盖板，实现超过 1.5 小时的无间断自动化。最后步骤为自动加入 xMAP® Sheath Fluid PLUS（含盖板与工作台振荡），再使用 Luminex® 仪器完成数据采集。
该自动化流程在所有可行步骤均实现最大化无人值守操作，支持高通量、高重复性与可扩展性。整体实验步骤的对比详见图7。
图7.MILLIPLEX®Panel A 手动实验方案与 AAW™自动化实验方案的对比示意图，AAW™工作站可全自动完成初始液体转移、实验设置与盖板操作，大幅降低过夜与当日实验方案的人工操作需求。过夜实验在完成工作台设置与封板后即可进入无人值守阶段，当日实验则通过自动化设置与工作台内孵育实现超过 2 小时 20 分钟的连续无人值守，当日实验的所有初始步骤均无需人工操作，无人值守阶段包括 AAW™流程中的步骤 1、2、4、5、7。在步骤 2 中，当日实验为工作台内孵育 2 小时，由机器人自动盖板，全程无需值守，而过夜实验为工作台外孵育，仅需手动封板后便可过夜无人值守。图示采用颜色标识操作类型，灰色代表手动需人工操作的步骤，紫色代表自动化无人值守的步骤，初始孵育结束后，步骤 3 至 8 为当日实验与过夜实验的共用步骤，两种方案在洗板后的试剂处理阶段均能实现超过 1.5 小时的无人值守自动化运行。
下一部分将展示通过手动与自动化实验运行获得的验证数据与对比结果。
结果与验证：自动化MILLIPLEX®检测与手动检测对比
为验证检测性能、精密度及样本结果一致性，采用 AAW™工作站进行的自动化 MILLIPLEX® 人细胞因子 Panel A 检测，与已建立的手动实验方案进行了直接对比，所有质控品及检测结果均参照制造商标准进行评估，以确认自动化流程符合所需的精密度及性能要求。
质量控制与批内精密度
质控合格率
每个自动化检测批次均包含试剂盒提供的两种质控品（QC1 和 QC2），并参照制造商针对该批次设定的可接受范围进行评估，对于全部 48 种分析物，自动化平台获得的 QC1 和 QC2 结果均稳定落在试剂盒规定的质控可接受范围内，证实了自动化实验方案的可靠性能及良好的整合性。
批内精密度
精密度评估通过手动与 AAW™自动化两种方案，对所有分析物的 8 个质控品复孔（n=8，每孔做双复孔）进行分析得出，自动化检测始终保持良好的批内精密度，所有分析物的变异系数（% CV）均低于 15%，且大多数低于 10%，符合公认标准，与手动实验方案的性能相当，这些结果表明自动化检测具有良好的精密度和可重复性，能够支持可扩展且可靠的实验室工作流程。
样本相关性：自动化方案 vs 手动方案
采用过夜实验模式，通过手动与自动化两种方案对 38 份人血清样本进行平行分析，所用检测 panel 为 47 重（因 RANTES 需特殊稀释处理，故予以剔除）。以决定系数（R²）评估自动化与手动方案的检测一致性，设定 R²＞0.95 为可接受标准。
该批血清样本中，有 24 种分析物的生物标志物水平覆盖较广的动态范围，为自动化与手动方案间的稳健相关性分析提供了条件；通过以手动检测结果为横轴、自动化检测结果为纵轴绘制散点图，证实了这些分析物的样本相关性良好。
图 8 展示了 6 种代表性分析物，其回归斜率介于 0.80~1.20 之间，且 R² 均＞0.95，符合领域内方法学相关性与比例性的可接受标准，证实自动化与手动检测的定量性能具有一致性。此外，自动化方法可同时处理多个样本，降低了人为误差风险，为高通量应用提供了更高的可靠性与效率。
图8.6种细胞因子、趋化因子及生长因子分析物的代表性散点图（自动化 AAW™方案与手动方案对比）（A）白细胞介素 - 6（IL-6）、（B）白细胞介素 - 8（IL-8）、（C）白细胞介素 - 9（IL-9）、（D）白细胞介素 - 10（IL-10）、（E）肿瘤坏死因子 α（TNFα）及（F）血管内皮生长因子 A（VEGF-A）。 散点图中，横轴为手动方案测得的浓度（pg/mL），纵轴为自动化 AAW™方案测得的浓度（pg/mL），并为每种分析物计算了回归线及决定系数（R²）。所示所有分析物的R²均＞0.95，回归斜率介于 0.80~1.20 之间。本研究使用的血清样本由华盛顿大学医学院 / 费尼格实验室通过学术合作提供，且已获得用于对比检测研究的事先批准。
总结
AAW™工作站是一款具备用户友好界面的自动化液体处理机器人，旨在实现高通量 MILLIPLEX® 多重免疫检测流程（如 MILLIPLEX® 人细胞因子 Panel A）的自动化，显著减少人工操作时间。该系统经验证具备良好的检测精密度与一致性，其质控合格率及批内变异度均达到或优于手动方案。通过无缝自动化手动检测流程（包括样本上样、试剂加样及孵育），AAW™工作站为多重细胞因子定量分析及常规生物标志物研究提供了稳健的平台。
与自动洗板模块整合后，AAW™工作流程除工作台外洗板及过夜孵育步骤外，可实现所有检测步骤的自动化，进一步提升了样本通量及标准化程度。这种稳健的方法可获得变异系数（% CV）较低的可重复结果，样本检测性能接近或超越手动方案，使其成为各类研究领域中可扩展生物标志物分析的理想解决方案。
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