磷酸钙转染是将DNA导入真核细胞的常用方法。该技术已在多种细胞类型中获得了瞬时1并且稳定2的转染。该方法是基于将含有磷酸钠的HEPES缓冲盐水和含有DNA的CaCl2溶液进行缓慢混合实现的。所形成的DNA-磷酸钙共沉淀物可粘附于细胞表面,并可能通过胞吞作用被细胞吸收。甘油休克可以增加某些细胞类型的DNA摄取。
磷酸钙转染试剂盒(货号CAPHOS)中提供的试剂是经0.2 µM滤器无菌过滤并灌装的。该试剂盒可供:
磷酸钙转染试剂盒(货号CAPHOS)中包含:
在-20 °C储存所有组分。
在使用前将所有试剂盒组分解冻并平衡至室温。
下述方法适用于用将1 μg/μL pSV40-CAT质粒(在无菌分子生物级水中稀释)转染至CHO细胞。在适合细胞类型的标准含血清或无血清培养基中进行细胞培养。该过程不推荐使用抗生素。应使用良好的无菌技术,并且仅使用无菌材料进行操作。
DNA质粒应该是高质量的,经乙醇沉淀,并重悬于分子生物级水中,终浓度为1 μg/μL。
该实验步骤可经优化用于各种细胞类型。其中接种密度、使用的DNA量、孵育时间以及甘油休克,均可在需要时进行修改以实现更高的表达和更低的毒性。
第一天:接种细胞 按照下表进行细胞接种:
第二天:转染
2.两小时后,按下述操作在两个试管中制备转染试剂:
3.将移液器泵连接至装有200uL移液头的1mL血清移液管上,并使用该自动移液器泵对HeBS(管B)鼓泡。
4.在鼓泡HeBS(管B)的同时,逐滴添加管A(来自步骤2)的内容物。
5.涡旋2 - 4秒。
6.随后,让沉淀物静置20分钟。
7.将溶液均匀地滴在孔板中的细胞培养基上。轻轻搅动培养皿,使沉淀物均匀分布在培养皿中的细胞上。
8.将细胞孵育过夜(约16小时)。
第三天:甘油休克(可选)
2.从培养皿中取出培养基并更换甘油溶液。孵育2分钟。
3.移除甘油溶液,并用PBS洗涤两次:
第三天:更换培养基
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