超氧化物歧化酶的酶学测定

1.目标

建立超氧化物歧化酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有酶促测定超氧化物歧化酶活性的产品。

3.定义

• 纯水：产自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC
• 单位定义：单位定义 — 在pH 7.8、25 °C、3.0 mL反应体积，使用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶的情况下，一单位可将酶偶联系统的细胞色素c还原率抑制50％。黄嘌呤氧化酶浓度应为每分钟可产生0.025 +/- 0.005的初始（未抑制的）ΔA_550nm。
• XOD — 黄嘌呤氧化酶
• SOD — 超氧化物歧化酶
• O2^¯∙ - 超氧自由基

4.讨论

超氧自由基是由黄嘌呤氧化酶催化的酶促反应产物：
黄嘌呤 + O₂ + H₂O ^XOD > 尿酸 + O₂^¯ + H⁺

氧化型细胞色素c被超氧自由基还原。用分光光度仪跟踪550 nm处的还原速率：
细胞色素³⁺ c + O₂^¯∙ > 细胞色素²⁺ c + O₂

超氧化物歧化酶通过竞争超氧自由基来抑制细胞色素c的还原：
2 O₂^¯∙ + 2 H^+    SOD   > O₂ + H₂O₂

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅材料安全数据手册(MSDS)。

7.操作流程

7.1 条件：T = 25 °C, pH = 7.8, A_550nm, 光程 = 1 cm

7.2 方法：连续光谱法速率测定

7.3 试剂：

7.3.1 216 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.8，25 °C（缓冲液）利用纯水和磷酸氢二钾三水合物（货号P5504）配制49.3 mg/mL的溶液。  使用1 M KOH或1 M HCl在25 °C下将pH调节至7.8。

7.3.2 乙二胺四乙酸溶液（EDTA）：  利用纯水和乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（货号ED2SS）配制4.0 mg/mL的溶液。

7.3.3 1.1 mM细胞色素C溶液(Cyt C)：利用纯水和细胞色素C（货号C7752）配制14.6 mg/mL的溶液。

7.3.4 0.108 mM黄嘌呤溶液（黄嘌呤）：将1.64 mg黄嘌呤（货号X0626）溶于90 mL纯水中。一边搅拌，一边加入少量1 N KOH直至所有黄嘌呤溶解。将溶液定量转移至100 mL容量瓶中，用纯水定容至100 mL。

7.3.5 黄嘌呤氧化酶溶液（XOD）利用低温纯水和黄嘌呤氧化酶（货号X1875）配制约5单位/mL的溶液。放在冰上。

7.3.6 临使用前，利用低温纯水和试剂XOD配制含有0.05单位/mL黄嘌呤氧化酶的溶液。该浓度可能需要调整以满足第7.4.3节的要求。

7.3.7 超氧化物歧化酶溶液：临使用前，利用低温纯水和超氧化物歧化酶配制10单位/mL的溶液。

7.4 测定规程

7.4.1 将下列试剂(mL)加入适宜的容器，以制备反应混合物：

7.4.2 混匀，在25 °C下视必要用1M HCl或1M KOH调节pH至7.8。

7.4.3 黄嘌呤氧化酶检查：

7.4.3.1 将以下溶液(mL)加入适宜的比色皿：

7.4.3.2 使用适当的恒温分光光度计平衡至25 °C。监测稳定之前550nm处的吸光度，然后添加：

7.4.3.3 倒置混合，并记录约5分钟内550 nm处吸光度的增量。对于该反应，与空白相比，未抑制的吸光度变化应为0.025 +/- 0.005。否则调整试剂7.3.6的浓度并重复7.4.3步内容。

7.4.4 将下列试剂(mL)加入适宜的比色皿：

7.4.5 使用适当的恒温分光光度计平衡至25 °C。监测稳定之前550nm处的吸光度，然后添加：

7.4.6 倒置混合，并记录约5分钟内550 nm处吸光度的增量。对于未抑制的反应，以一分钟的间隔，获取最快的线性速率。使用此时间间隔，获取每个试样和空白的速率。

7.4.7 每个抑制试样的ΔA_550nm应落在未抑制速率的40-60％之内。超出此范围的任何值均视为无效。

7.5 计算

DF = 稀释系数
50％ = 每个定义单位抑制细胞色素c的还原率
0.10 = 每份试样所用的酶体积(mL)

7.6 最终测定体系浓度：
在3 mL反应物中，终浓度为50 mM磷酸钾，0.1 mM乙二胺四乙酸，0.01 mM细胞色素c，0.05 mM黄嘌呤，0.005单位黄嘌呤氧化酶和1单位超氧化物歧化酶。