转化酶的酶学测定

1.目标

建立转化酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有酶促测定转化酶活性参数的产品。

3.定义

3.1.纯化水 — 去离子水，电阻率 ~ 18MΩ•cm @ 25 ºC

3.2.单位定义 — 在55 ºC、pH 4.5条件下，一单位每分钟可将1.0 μmole的蔗糖水解为转化糖

4.讨论

蔗糖 +H₂O ^转化酶 >葡萄糖 + 果糖
葡萄糖和果糖均作为还原糖测定。

5.责任

分析服务人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1.条件：T=55ºC，Abs₄₁₀，pH=4.5，光程 =1 cm

7.2 方法：
光谱法终止反应

7.3试剂：

7.3.1.   100 mM乙酸钠，pH 4.5， 55ºC（缓冲液）
利用纯水和醋酸钠三水合物（货号S8625）配制13.6 mg/mL的溶液。用1M HCl调节pH（55ºC）。

7.3.2.   1.0%w/v 蔗糖底物（蔗糖）
利用试剂7.3.1和蔗糖（货号S7903）配制10 mg/mL的溶液。须现配现用。

7.3.3.   转化酶（酶）
临使用前，利用低温纯水和转化酶配制0.3-0.4单位/mL的溶液。建议：为了增加样品的溶解度，称量产物到wig-l-bug中并相应地稀释。

7.3.4.   0.5 MNaOH（NaOH）
利用纯水和1 N NaOH（货号S2567）配制1:2 稀释液。

7.3.5.   0.5% w/v PAHBAH（PAHBAH）
利用试剂7.3.4和对羟基苯甲酰肼（货号H9882）配制5 mg/mL的溶液。须现配现用。

7.3.6.   5.56 mM葡萄糖标准溶液（STD SOLN）
利用纯水和葡萄糖标准品（货号G8270）配制1.0 mg/mL的溶液。

7.4 试验方法

7.4.1.   将以下内容（毫升）移入合适的容器中：

7.4.2.   摇动混合并平衡至55 ºC。然后添加：

7.4.3.   摇动混合并在55 ºC培养20分钟整。培养 20 min 后摇动并倒置试管。

7.4.4.   各反应混合物各取0.10mL，加入含有下列内容物的单独试管：

7.4.5.   立即摇动混合。在每个试管上放一个大理石或透气的盖子，然后放入沸水浴中。

7.4.6.   煮试管 5 min。试管可以在反应停止后15分钟内一起煮。

7.4.7.   从沸水浴中取出，冷却至室温。

7.4.8.   旋转混合并将溶液转移到合适的比色皿中。使用合适的分光光度计测量所有反应混合物在410 nm处的吸光度。

7.5 计算

7.5.1.   标准曲线：

校正吸光度：ΔA_410nm Std = A_410nm Std - A_410nm Std Blank

将 ΔA410nm_410nm Std与葡萄糖的微摩尔量的相对关系绘制称标准曲线。

7.5.2.   校正的ΔA_410nm 测试 =A_410nm 测试 - A _410nm 测试空白

式中：
   df= 稀释系数
20 = 测定时间(min)
0.1 = 所用的酶体积(mL)
2 = 1 μmol蔗糖水解为葡萄糖和果糖的换算系数