引物浓度优化实验方案

qPCR条件优化

QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。 

优化引物浓度的一种方法是建立一个反应阵列。该阵列用来对照伴侣引物的不同浓度来测试每种引物的一系列浓度。本实验方案给出的示例是用一个6×6阵列测试六种浓度（例如50 nM至800 nM）。本实验方案所述的数量都允许每个条件一式两份运行。

引物浓度优化实验方案中使用的设备

• 定量PCR仪器
• PCR设置的层流罩（选购件）

试剂

• 合适的测定模板，例如1:10稀释的cDNA、gDNA或合成的寡核苷酸模板。
• KiCqStart^® SYBR^® Green ReadyMix™（KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，有关仪器兼容性，请参见表 P4-6）。
• PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
• 正向和反向引物浓缩原液（10 μM工作原液）。
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耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
• PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  • 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）
  • 孔板
    - 96孔板（Z374903）
    - 384孔板（Z374911）
  • 孔板密封
    - ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)
    - ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)

本方案注意事项

• 使用随机引物或oligo-dT引发方法产生cDNA，并以1:10稀释备用，但也可以使用任何合适的替代模板。
• 根据板的布局，所有样品一式两份运行（图P13-18）。

方法

注意：将2.0 μL的每种引物加入到总体积为20 μL的反应物中。为此，需要10倍所需浓度原液才能达到所需的最终浓度。

1.    使用10 μM引物原液，将两种引物原液稀释至0.5、1、2、4、6和8 μM，
如表P13-32所示。

2.    按照表 P13-33制备qPCR预混液。   
       （注意：步骤5中的模板和cDNA应分开加入）。充分混合。

*注意：在步骤5之前不要添加cDNA和引物。

3.    将步骤2中的184.8 μL预混合物（对12× NTC）移入单独的管中，用来设置
无模板对照（NTC）反应。

4.    将26.4 μL的dH2O添加到步骤3中的NTC混合物中（以替换模板）。
       注意：将NTC混合物置于冰上以备后用。

5.    将158.4 μL cDNA模板添加到步骤2中剩余的预混液中。将预混液置于冰上。

6.    根据图 P13-18，将2.0 μL适当的反向引物稀释液添加至PCR板中，再将
800 nM浓度溶液添加到NTC行。

7.    根据图 P13-18，将2.0 μL适当的正向引物稀释液添加至PCR板中。

8.    将步骤5中的16 μL预混液等分到PCR板上对应测试反应位置的孔中。

9.    将步骤4中的16 μL 预混液等分到PCR板NTC反应孔中。

10.  封板并贴好标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）

11.  根据表 P13-34的两步实验方案运行样品。重复执行第1-2步40次，然后进行解离曲线分析。

说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。