酯酶的酶促测定

1.目标

建立使用丁酸乙酯作为底物对酶促测定酯酶活性的标准化方法。

2.适用范围

该流程适用于可检测酯酶活性的所有产品。

3.定义

3.1.纯水 - 来自去离子系统的水，电阻率~18MΩּcm@ 25 °C

3.2.活力单位定义 - 一个单位可在pH8.0、25 ºC下每分钟将1.0 μmole丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇

4.讨论

丁酸乙酯 + H₂O    ^酯酶   >丁酸+乙醇

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1.条件
T = 25℃，pH 8.0

7.2.方法 滴定速率测定

7.3.试剂：

7.3.1   10mM硼酸盐缓冲液（缓冲液）
使用硼酸（例如货号B0252）在纯水中制备0.62 mg/mL溶液。用1N NaOH将pH调节至8.0

7.3.2 丁酸乙酯（EB Neat）
使用丁酸乙酯（例如Sigma-Aldrich货号E15701）进行制备。

7.3.3   标准化氢氧化钠 
使用1 N氢氧化钠（例如货号S2567）在纯净水中制备合适的稀释液。 

7.3.4   0.01 N氢氧化钠滴定液（NaOH）
使用标准化的试剂7.3.3在纯净水中制备0.01 N氢氧化钠溶液。须现配现用。

7.3.5 酯酶溶液（酶）
在使用前，立即在冷试剂7.3.1中制备含约50单位/mL的溶液。

7.4.操作流程

7.4.1.   将以下试剂（以毫升计）移液到合适的滴定容器中，并同时使用合适的pH计、磁力搅拌器和恒温水浴：

7.4.2.   在搅拌条件下于25 ℃进行平衡。然后加入以下成分(ml)：

7.4.3.   在搅拌条件下于25 ℃进行平衡。使用试剂7.3.4(NaOH)将pH调节在8.1-8.2的范围内。然后加入以下成分(ml)：

7.4.4.   监测反应混合物的pH，直至pH达到8.0。此时，在累积模式下使用计时器，同时添加0.100mL试剂7.3.4(NaOH)并启动计时器。（如步骤7.4.6所述，可根据需要调整NaOH滴定剂的等分试样）

7.4.5.   当反应混合物的pH值再次达到8.0时，再加入0.100mL试剂7.3.4(NaOH)的等分试样（或与7.4.4中所使用的相同体积），并记录所经过的时间。

7.4.6.   重复步骤7.4.4和7.4.5约5分钟。在此期间应该添加大约10次滴定剂。并且至少需要添加5次滴定剂。如果未满足最低添加要求，请调整步骤7.4.4和7.4.5中使用的滴定剂体积。

7.4.7.   将所用滴定剂的体积（以毫升计）与时间（以分钟计）进行作图，并确定每个样品和对照组图的斜率。

7.4.8.   按照步骤7.4.1至7.4.4进行空白实验，用纯净水（酶稀释剂）替换酶等分试样。如果反应混合物的pH在60分钟内没有达到8.0，则将记录60分钟作为空白速率。该时间（Tb）需用于计算。空白实验可在样品之前进行。如果空白速率几乎可以忽略不计，则可以使用另一个计时器并将空白反应混合物放在一边。但应在样品实验之间定期检查pH值。

7.5 计算

7.5.1.   斜率可通过将试剂7.3.4(NaOH)的0.100mL（或步骤7.4.4和7.4.5中使用的体积）等分试样的消耗速率除以时间获得。

VT = 用于将反应混合物的pH保持在8.0所需试剂7.3.4（NaOH）的体积（以毫升计）
 N_NaOH = 试剂7.3.4（NaOH）的一般工作浓度
1000 = 从毫摩尔转换为微摩尔的转换比例
 m = 从7.5.1中所得的斜率
 T_b = 从7.4.8中所得的空白组经过时间
 0.1 = 使用的酶的体积（以毫升计）

7.6 初始分析浓度
在25.200mL反应混合物中，初始浓度为10mM硼酸盐、0.4％（v/v）乙酸丁酯和5单位酯酶。