缬沙坦中的N-亚硝胺测定

根据美国 FDA 指南进行药品质量控制的 GC-MS 方法

2018 年 7 月，药品监管机构获悉缬沙坦产品中存在亚硝胺杂质（N-亚硝基二甲胺，NDMA，图 1）。¹活性药物成分 (API) 缬沙坦是一种血管紧张素-II-受体阻滞剂 。这一成分用于治疗 ACE 抑制剂治疗不耐受患者的高血压、心力衰竭和心脏病发作。²缬沙坦属于一组结构相关的化合物（所谓的沙坦类），共有四唑基团（四个氮和一个碳组成的环） 。后来，其他亚硝胺杂质如 N-亚硝基二乙胺 (NDEA)、N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA)、N-亚硝基乙基异丙胺 (NEIPA) 和 N-亚硝基二丁胺 (NDBA) 经证也存在于其他沙坦家族药物及雷尼替丁药物中。随后全球范围召回使用散装缬沙坦原料药的药品，导致市场上缬沙坦类药物暂时短缺。

N-亚硝胺含有亚硝基官能团（-N=O）。根据世界卫生组织 (WHO) 国际癌症研究机构 (IARC) 的报告，大多数亚硝胺对动物具有致癌性和遗传毒性，对人类也可能是致癌物。监管机构和原料药生产商发现，在生产过程中，仲胺或叔胺与亚硝酸盐在酸性条件下反应会形成亚硝胺。沙坦类药物需要亚硝酸钠来形成四唑环，导致形成 N-亚硝胺。亚硝胺也可能由受污染的溶剂、试剂或生产设备引入。³这导致了欧洲药典（Ph.Eur.)委员会拟定原料药中亚硝胺含量暂定低于1 ppm，并于2020年底降低至30 ppb。⁴

此类限值范围的测定需要高灵敏度和高选择性的分析技术。大多数方法使用 GC-MS 或 HPLC-MS。^5-7这类分析面临的另一个挑战是亚硝胺、API 和配方的多样性，这需要专门定制的杂质检测方法。

这项工作要求根据美国 FDA 指南，制定通过 GC-MS/MS 在 EI MRM 模式测定缬沙坦药品中的 5 种痕量亚硝胺杂质（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA）的操作步骤。FDA 检测和研究办公室 (OTR) 发布的一种方法奠定了相关方法开发的基础。⁸方法验证是根据 USP 的要求进行。⁹

实验

GC-MS/MS 方法使用液体进样，涵盖多种亚硝胺。与 OTR 方法相反，选择了更低膜厚度（0.5 µm 而不是 1 µm）的蜡柱。但这符合 USP 通则 <621> 关于色谱法的规定。¹⁰色谱条件以及 MS/MS 条件如表 1 至 3 所示。

不到 10 分钟即可充分分离五种亚硝胺，并且目标峰与溶剂峰和基质峰很好地分离（图 2）。与 FDA OTR 方法相比，观察到的保留时间较短，可能由于 GC 柱膜厚度较低。

通过对两组转换的多反应监测 (MRM) 实现了低检测限。图 3 显示了两个示例，即最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA 和 NDIPA 的色谱图，信噪比超过 10。

方法适用性

经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 % RSD ≤ 5%。使用我们的方法，两个 MRM 下连续六次进样 40 ng/mL 标准品，所有杂质的 % RSD 均小于 5%，如表 4 所示。

此外，线性校准曲线的相关系数(r²)应≥0.998。我们的方法在两种 MRM 下的所有五种亚硝胺均超过了该值（表 5）。

缬沙坦药品应用

在当地药房购买的商业缬沙坦产品中添加亚硝胺杂质，浓度达到 10 ppb（NDBA 为 40 ppb）。测定发现亚硝胺的回收率分别在 94.5% 至 105.7% 范围内（表 6）。

FDA-OTR 方法报告缬沙坦产品亚硝胺测定的定量限 (LOQ) 在 8 – 40 ppb 范围内。我们的方法在缬沙坦药品中达到了更低的 LOQ（表 7）。LOQ 根据化合物信噪比 (S/N) 10下的校准曲线计算，并通过缬沙坦片剂的标准补充实验进行验证。使用信/噪比 (S/N) 3计算检测限 (LOD)。

总结

根据 FDA-OTR 建议的方法，可使用 SUPELCOWAX^® 色谱柱，通过 GC-MS/MS 在 MRM 模式下轻松测定亚硝胺杂质。所有亚硝胺间以及亚硝胺与溶剂和基质之间均实现良好的峰分离，满足系统适用性要求。该方法成功应用于掺有亚硝胺杂质的缬沙坦药品分析。

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