核糖核酸酶A(EC 3.1.27.5)的酶促测定

说明

本实验方案可用于测定核糖核酸酶A(RNase A)的活性。分光光度测量法(Spectrophotometric Stop Rate Determination)[300 nm处的吸光度(A₃₀₀)，光程= 1cm]基于以下反应：

RNase A
核糖核酸 + 水 –––––––––––> 寡核苷酸

单位定义：在pH 5.0、25 °C条件下，每分钟使E₀ – E_f的值下降100%的核糖核酸酶A量定义为一个酶活单位。

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

所需试剂和设备

三水乙酸钠（货号S8625）
核糖核酸（货号R6750）

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

缓冲液（100 mM乙酸钠，pH 5.0，25 °C）— 使用三水乙酸钠（货号S8625）在超纯水中配制13.61 mg/mL溶液。用 2 M乙酸调至pH5.0(25 °C) 。

RNA溶液[0.1% (w/v)核糖核酸溶液] — 使用核糖核酸（货号R6750）在缓冲液中制备~1 mg/mL溶液。摇动或颠倒确保溶解。切勿使用搅拌棒。溶解最多可能需要30分钟。RNA溶解后，在开始检测前务必先核对RNA浓度。在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂并颠倒混匀：

ΔA₃₀₀底物 = A₃₀₀底物 – A₃₀₀空白。ΔA₃₀₀底物值必须在0.73±0.025之间，根据需要用适量的缓冲液或固体核糖核酸调节吸光度值。

酶溶液（RNase溶液）— 在冷的超纯水中配制50–75 Kunitz单位/mL的RNase储液。

• 总水解测定(E_f) — 用冷的超纯水将RNase储液稀释至终浓度0.50–0.75 Kunitz单位/mL的溶液。
• 速率测定(E₀) — 临用前配制，用冷的超纯水将RNase储液稀释至终浓度0.20-0.30 Kunitz单位/mL的溶液。

操作流程

总水解测定(E_f)

在3.00 mL反应液混合物中，最终浓度为50 mM乙酸钠、0.05%（w/v）RNA和0.75-1.13 Kunitz单位的RNase A。

1.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂。准备三份平行试样。倒置混合。

2.将适宜的温控分光光度计平衡至25 °C，用空白皿调零。

3.每隔1分钟监测试样皿的A₃₀₀吸光度值，持续约120分钟，或至ΔA₃₀₀/min ≤0.002。当速率维持5分钟不变时，底物彻底水解。

4.三份平行试样的最终吸光度值的一致性应达90%。

速率测定(E₀)

在3.00 mL反应液混合物中，最终浓度为50 mM乙酸钠、0.05%（w/v）RNA和0.04–0.06 Kunitz unit的RNase A。

1.分光光度计设为25 °C，空白皿调零，按总水解测定(E_f)步骤1准备试样。

2.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂：

3.颠倒混匀，在分光光度计中平衡至25 °C。

4.然后添加：

5.立即颠倒混匀，每隔1分钟记录A₃₀₀的下降，至少记录10分钟。

底物污染测定

1.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂并颠倒混匀：

2.ΔA₃₀₀底物 = A₃₀₀底物 – A₃₀₀空白。

3.ΔA₃₀₀底物与RNA浓度核对值（见制备说明节的RNA溶液）的差异必须在20%以内，检测才有效。差异>20%代表RNA底物被污染。 

结果

计算

1.

绘制ln(E₀ – E_f)对时间（分钟）的曲线，测定斜率。

2.

式中：
3 = 检测总体积 (mL)
df = 稀释倍数
mL，酶 = 第4步速率测定(E₀)中加入的酶溶液体积

3.