通用SYBR Green qPCR实验方案

技术槪述
测定的考虑因素
定量方法
设备及耗材
PCR混合液选择指南
实验方案
故障排除
材料
参考文献

技术槪述：SYBR Green qPCR

随着具有荧光检测功能的热循环仪的发展，PCR具有了新的创新应用。在常规PCR中，关键结果是在该过程后产生的最终扩增子数量。实时或定量PCR和RT-PCR利用DNA扩增的线性原理，确定样品中已知序列的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报告基团，可以测量DNA产量。

在定量PCR中，会监测每个PCR循环中的DNA扩增。当DNA处于对数线性扩增阶段时，荧光量相对于背景增加。荧光变得可测的那一点称为定量循环（C_q）或交叉点。通过多次稀释已知量的标准DNA，可以产生C_q的对数浓度标准曲线。然后可以根据C_q值计算未知样品中DNA或cDNA的量。

A) 反应的不同阶段：
基线：模板初始浓度低，因此荧光强度太低而不能被检测到，只有背景信号明显存在。
指数：在靶样产量达到检测阈值（显示为红色阈值线）后，可在整个指数阶段可以跟踪反应过程。
线性：随着模板浓度的增加，可用的DNA聚合酶浓度下降，反应速率降低。
高原：没有足够的游离酶继续扩增，因此在这个点之后，反应处于最大产量期，也就是平台期。

B) 个体反应的特征在于荧光首先升高到阈值以上的循环，其被称为定量循环 (C_q)。如果起始材料丰富，则会在较早的循环中观察到扩增，这种情况中C_q较低。如果起始材料稀缺，则在后续循环中观察到扩增，C_q较高。荧光、C_q和扩增产物的量之间的这种相关性，使得我们能够在宽动态范围内定量模板。

实时PCR也适用于相关研究。可以使用对每个待扩增区域独特的引物进行反应，并用不同的荧光染料标记。几种市售的定量热循环仪包括多个检测通道。在该多重系统中，可以将靶DNA / cDNA的量与管家序列（例如GAPDH或β-肌动蛋白）的量进行比较。

测定方案考虑因素

DNA制备

确保PCR成功最重要的一步是高质量的DNA制备。DNA模板的完整性和纯度至关重要。定量PCR涉及多轮酶促反应，因此对蛋白质、苯酚/氯仿、盐、EDTA和其他化学溶剂等杂质更加敏感。污染物也会干扰荧光检测。260nm和280nm处的吸光度值的比率给出了DNA纯度的估计值。纯DNA的A260 / A280比率为1.8-2.0，较低的比率表明存在诸如蛋白质的污染物。

模板

启动qPCR需要非常少的靶核酸变性（相当于约100 pg的gDNA或cDNA）。为最大限度减少反应抑制剂的污染，应将起始模板量保持在实现精确定量所需的最小值。当起始材料是RNA时，引物设计和DNase I处理将减少可能由gDNA污染产生的信号。

引物设计

无论是使用dsDNA结合染料还是基于探针的检测化学，设计高质量引物都是qPCR中最关键的实验前步骤之一。应使用引物设计软件来设计PCR特异性引物，以消除引物二聚体和二级结构引入的复杂问题。引物浓度过低会降低引物二聚体形成和非特异性产物积累，在定量PCR中使用SYBR Green I染料时这一点尤为重要。

dNTP

标准PCR / qPCR预混液含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP。然而，有些可用的混合物用dUTP代替了dTTP。使用dUTP进行的先前反应的产物将含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。所以它们易受尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UNG）切割。因此，事先用UNG孵育后续反应物可防止反应之间的携带污染物。为确保高效，实验室中的所有反应都必须使用dUTP。

镁浓度

氯化镁 (MgCl₂) 是逆转录酶、Taq DNA聚合酶和Taq DNA 5'至3'核酸外切酶活性必需成分。含有DLP的反应物的最佳Mg²⁺浓度通常在3 - 6 mM之间。氯化镁浓度越低，通常形成非特异性产物越少。某些ReadyMix溶液以2X浓度的7 mM氯化镁（终浓度为3.5 mM）提供。在某些情况下，如果需要，可提供一小瓶25 mM氯化镁溶液以进一步优化最终的氯化镁浓度。有时可能需要不含MgCl₂的反应混合物，从而可以使用更低的反应浓度——例如使用Scorpion探针检测时。

逆转录酶

提供高产量cDNA、同时在高温下保持活性的逆转录酶对RT-qPCR的成功至关重要。其在高温下的高效酶性能有助于去除具有显著二级结构的RNA区域的稳定性，从而易于杂交和随后扩增。当进行一步法RT-qPCR时，高温性能允许使用具有高解链温度(T_m)的基因特异性引物，增加了反应特异性。当进行两步法方案时，重要的是确保酶能够使来自RNA的cDNA具有线性、成比例的产率。尽量减少移液步骤可以减少差异性。一些ReadyMix包含进行RT所需的引物和其他试剂，例如ReadyScript^® cDNA合成混合物（RDRT）。

Taq DNA聚合酶

就像RT需要选择最合适的逆转录酶一样，适当的DNA聚合酶选择至关重要。天然Taq DNA聚合酶的一个基本问题是酶在低温下具有残余活性。这种残留的聚合酶活性会导致非特异性引物结合，进而形成非特异性产物。抗体阻断或化学阻断的Taq DNA聚合酶（“热启动”）有助于通过阻止酶活性来纠正这种情况，直到高温变性步骤开始。请参阅《PCR混合液选择指南》确定适合您应用的最佳热启动聚合酶。

按仪器类型选择内参染料

一些实时PCR热循环仪需要ROX等上样染料来控制光学系统的可变性，并标准化信号强度的差异。同样地，一些热循环仪在使用SYBR Green I染料（具有非常低的背景）检测试剂盒时，需要荧光素来产生虚拟背景。这些组分可以在ReadyMix中提供，也可作为单独的组分提供，因此可选用适当的浓度。在某些情况下，会包括一小瓶用于反应标准化的内参染料。该染料的最大激发波长为586nm，最大发射波长为605nm。ROX参比染料的标准仪器设置非常适合内参染料测量。这种内参染料是ABI序列检测系统所必需的。

仪器

需要选择与仪器兼容的试剂。平台可使用不同的标准化染料，因此需要选择具有相容标准化染料的试剂（请参见附录1）。

许多qPCR仪器设计用于支持特定范围的应用，例如，ABI 7900支持高通量、384孔板自动上样，而Illumina Eco支持单个48孔板应用。最合适的仪器需要满足研究要求。理想的做法是选择具有用户友好软件的仪器，既可执行最想要的功能，又具有灵活的数据输出方式，以便下游统计分析软件程序包处理数据。这可减少培训人员所需的时间，可获得优异的分析结果。所需的其他功能包括一个绝对一致的PCR模块（96个重复孔的最大绝对偏差为1C_q = 2倍），以及一个光学系统，可以在很宽的波长范围内灵敏、均匀地激发和检测发射光。此设计允许广泛地选择荧光团，实现多重检测。另外还要考虑的其他特性是特定耗材相关的运作成本，例如，如果在反应中不使用标准微量滴定板，就需要考虑非标准型上样板或管的方便性。

对照

阳性对照始终有助于确保所有的试剂盒组分正常工作。无模板 / 阴性对照可确定是否存在污染。无模板对照信号表明存在DNA污染或引物二聚体形成。

缓冲液

缓冲液或反应混合物通常含有dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCl₂和稳定剂。根据检测化学试剂、仪器和反应要求，可能还需要SYBR Green I、ROX™、荧光素和惰性上样染料。PCR缓冲液组分和稳定剂通常是制造商专有的。由于每种成分都可以在反应中单独优化，如果单独购买，可最大限度提高灵活性。虽然所有组分混在一起的预混液用起来不太灵活，但它提高了批次的一致性和便利性，同时减少了移液步骤，从而减少错误和污染的可能性。

数据分析

建议使用推荐的实时仪器进行定量SYBR Green PCR。以下内容可能对仪器新用户有帮助。通常会绘制循环数与荧光的关系图。可通过循环阈值 (C_Ts)或交叉点确定每个样品中的模板量。循环阈值或交叉点是能够检测到PCR产物形成而导致荧光增加的第一个循环。交叉点之前的循环是基线循环。基线循环是指由于PCR产物的存在而引起荧光增加，但尚未达到可检测水平的循环。用于确定何时发生第一次可检测荧光增加的阈值也可以手动调节。必须在对数扩增图上绘出阈值。在对数扩增图中，阈值应设置在对数线性范围内，而不是高原阶段。

解链曲线

在运行结束时进行解链曲线分析将有助于仅分析目标PCR产物。按照实时仪器制造商的说明进行解链曲线分析。通过在另外的循环步骤中收集数据，可以修改使用相同引物的连续反应，以去除引物二聚体形成对产物信号的影响——但这一循环温度必须介于已经确定的二聚体和产物解链温度（T_M）之间。

定量方法

标准曲线

标准曲线对于绝对和相对定量都是必需的。当生成标准曲线时，应使用不同浓度的DNA（通常为5个）来生成标准曲线，该曲线将包含未知样品的浓度。每种浓度应一式两份。

绝对和相对定量

此SYBR Green PCR试剂盒可用于绝对或相对定量靶标DNA。绝对定量技术用于确定初始样品中靶标DNA量，而相对定量则确定靶标DNA量与参照扩增子之间的比率。理想的参照扩增子将具有不变的组成型表达。在实践中，可针对此功能选择管家基因，但还有其他参考选择更好地符合上述要求。¹

绝对定量使用外部标准品来确定目标靶核酸的绝对量。为了消除退火引起的定量差异，外部标准品的引物结合位点必须与靶标序列中的引物结合位点相同。理想的外部标准品序列与靶标序列相同或仅稍微不同。对于绝对定量，靶标与外部标准品之间的扩增效率必须相当。一旦确定出合适的构建体或扩增子，既可绘制​​外部标准稀释液的标准曲线，确定未知靶标浓度。

相对定量允许计算样品中靶标模板和参照模板之间的数量比。由于该方法测量靶样相对于假定不变的对照品的数量，因此相对qPCR最常用于测量遗传多态性差异，例如，组织之间或健康与疾病样品之间的差异。该技术的优点是使用内部标准可以最大程度地减小样品制备和处理中的差异。使用SYBR系统时，必须通过单独的反应运行靶标和内参定量。

相对定量的准确性取决于标准品中参照模板的适当选择。标准品的差异性将影响结果，因此必须确保标准品适当。¹一些研究人员选择不运行标准曲线，并以参照品的分数形式报告靶标数量，这种技术称为比较定量。另外，我们还可以假设靶标和参照的扩增效率可以忽略不计，而只基于参照序列确定的标准曲线定量靶标。最后，在最准确的相对定量技术中，需要测量参照和靶标的扩增效率，并确定校正因子。该过程称为标准化，¹ 需要含有已知浓度的靶标及参照，并且需要生成两条标准曲线。

PCR反应效率测定

通过为每个靶标制备连续稀释液，来确定参照与靶标之间的PCR效率。从靶样中减去参照样的CT值，并将这个CT值的差相对于模板量的对数作图。如果得到的直线斜率小于±0.1，则判断扩增效率相似。

设备

• 定量PCR仪器
• 微量离心机
• PCR设置的层流罩（选购件）

耗材

• qPCR SYBR Green混合液 — 请参阅qPCR选择指南（第1部分和第2部分）
• DNA / cDNA模板 — cDNA反应，以1:10稀释，用于检测中等至高度表达的靶样，或以1:2至1:5稀释，用于罕见转录或或10 ng至100 ng gDNA
• 正向和逆向引物，稀释至工作浓度（10 μM工作原液足以进行大多数检测）
  • 预先设计的基因表达引物也适用于大多数模型生物 (KiCqStart^® SYBR^® Green Primers, KSPQ12012)
• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（例如CLS430909）
• PCR管，选择匹配所需形式的试管：
  • 单个薄壁200 μL PCR管（Z374873或P3114）
  • 孔板
    • 96孔板(Z374903)
    • 384孔板(Z374911)
  • 封板膜
    • ThermalSeal RTS™密封膜(Z734438)
    • ThermalSeal RT2RR™膜(Z722553)
• PCR级纯水(W1754)

SYBR Green PCR 混合液选择指南 — 第1部分

SYBR Green PCR 混合液选择指南 — 第2部分

实验方案

准备

1. 将所有反应组分置于冰上。
2. 混合，然后短暂离心以收集管底部的内容物。

标准SYBR Green I染料反应

说明：我们观察到，当使用比常规PCR更高的引物浓度时，在KiCqStart ReadyMix中运行的测定是最佳的。在下面的实验方案中，我们使用450nM终浓度，观察到是几种独立实验的最佳浓度。

1.准备足够的预混液，以一式两份运行所有样品。
    a. 请务必包含一式两份无模板阴性对照样（NTC）。
    b. 根据所选的qPCR试剂选择下面的相应表格。
    c. 计算要混合的试剂量。增加10％的体积，以防移液错误时备用
    d. 混合均匀，避免气泡。

KiCqStart试剂的预混液：

其他完全qPCR ReadyMix的预混液 :

qPCR试剂与单独组分的预混液：

¹最佳MgCl₂浓度可以为1 mM至6 mM。
²请参阅附录1查找仪器的最佳参比染料浓度。

2.设置反应：
    a. 对于NTC反应，向反应管中添加4 μL水。
    b. 对于实验反应，向反应管添加4 μL cDNA溶液。
    c. 短暂离心所有试管。目测确认所有试管或孔在底部都含有正确体积的样品。
    d. 小心地将16 μL模板预混液等分到每个qPCR管或板孔中。
    e. 充分混合反应物并视需要离心。
    f. 给试管盖上盖子，或密封好板子，并贴上标签（根据仪器要求）。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）

3.根据仪器制造商的建议运行样品。下面将给出标准和快速循环的例子。

标准循环参数：

快速循环参数：

说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。

4.有关如何分析数据的指南，请参阅仪器手册。

附录1

推荐用于仪器的参比染料浓度。对于参比染料单独供应的qPCR试剂

故障排除指南