PURedit^™ Cas9 – 一种高度特异性且高效的基因组编辑RNP系统

• SpCas9为什么被广泛使用？
• CRISPR基因编辑PURedit™ Cas9 RNP系统的开发
• 我们Cas9蛋白变体的改造方法
• 对一种可产生优化性能特征的三重突变体Cas9蛋白的鉴定
• PURedit™ CRISPR Cas9 RNP系统和相关试剂

SpCas9为什么被广泛使用？

酿脓链球菌 CRISPR-Cas9（SpCas9）灵活且成本较低，常用作包括植物和人类等多个物种的主要基因组编辑工具。天然的SpCas9可耐受引导RNA序列和靶DNA序列之间的错配；然而，这常常会导致脱靶效应。为了克服这一缺点，几个小组已经通过基于结构的合理设计或定向进化开发出了各种具有更高特异性的SpCas9变体。然而，由于这些特异性增强的变体是在质粒过表达条件下选择的，当它们作为一种纯化的重组蛋白被递送并与体外转录或化学合成的引导RNA在预组装核糖核蛋白（RNP）复合物中进行结合时，它们的编辑效率通常会显著降低。在这里，我们对由我们高保真Cas9 Plus蛋白和我们PEXBUFF转染增强子组成的PURedit™ RNP系统的开发和性能进行了介绍。

CRISPR基因编辑PURedit™ Cas9 RNP系统的开发

为了维持特异性和活性，我们探索了不同的蛋白改造策略。该策略包括对可能参与到不同靶标DNA相互作用或Cas9核酸酶激活模式的关键残基进行鉴定和突变，以及对其性能进行评估。我们使用纯化的重组蛋白复合合成单链引导RNA（sgRNA）在人类细胞中对这些变体进行筛选。通过在一组靶位点和脱靶位点上对蛋白变体进行分层，我们鉴定出了几种兼具平衡的特异性和有利的单突变的蛋白变体。随后对这些变体进行组合试验，从而鉴定出同时具有优化的上靶和脱靶活性的突变。与此同时，我们也筛选了几种可提高Cas9 RNP复合物编辑效率的化合物，并鉴定出了一种能够提高这些高特异性变体在难以编辑的基因组位点上编辑效率的RNP增强子。因此，通过将其中一种高特异性的变体与RNP增强子相结合，我们开发出了适用于需要对Cas9 RNP复合物进行递送的基因组编辑应用的PURedit™ Cas9 RNP系统。

用于我们Cas9蛋白变体的改造方法

我们采用了一种多模式策略用于在SpCas9蛋白残基上引入突变，这些残基可能会参与到与非靶链DNA的糖磷酸主链的静电相互作用、引导RNA/靶链DNA异源双链的稳定性，以及REC3结构域介导的HNH核酸酶激活。此外，与之前无论残基具有怎样的结构或功能特征而都统一将其突变为丙氨酸的Cas9特异性提升方法不同，我们采用了一种结构相似的取代策略来尽可能减少活性的降低。图1展示了整体的蛋白改造工作流程。同时，我们还筛选了一系列的化合物用于鉴定Cas9 RNP复合物的电穿孔增强子。

对一种可产生优化性能特征的三重突变体Cas9蛋白的鉴定

维持Cas9的活性并同时提高其特异性，是一个微妙的平衡行为。我们的数据表明，将一个相关的残基突变为其他结构相似的残基更有可能实现这种平衡。我们还发现，一些单突变体和双突变体能够显著提高特异性并保持野生型的活性；然而，它们仍然可能对单错配的脱靶位点产生高水平的脱靶效应。因此，我们在后来的改造周期中对三重和四重突变进行了探索，并确定了一组能够最大程度有效降低单错配脱靶效应并同时保持相当的野生型活性水平的三重突变体（图2-4）。通过将其中一种三重突变体与Cas9 RNP增强子结合，我们开发出了PURedit™ Cas9 RNP系统。

PURedit^™ CRISPR Cas9 RNP系统和相关试剂

我们开发了一组高特异性的SpCas9蛋白变体，它们通过多模式蛋白改造和RNP复合物递送而保持了高水平的活性。我们还鉴定出了一种Cas9 RNP电穿孔增强子，用于提高Cas9 RNP的编辑效率，特别是在难以编辑的基因组位点上。通过将其中一种高特异性变体与RNP增强子结合，我们开发出了PURedit^TM RNP系统，与其他商业高保真或高效率Cas9蛋白产品相比，它能够实现有效的基因组编辑并显著降低脱靶效应（图5）。

如需更多资源，请探索我们的预设计CRISPR gRNAs、设计定制gRNA或选择最适合您需求的定制gRNA。如有更多问题，请与我们的专家进行联系。