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主页PCR的应用标准PCR实验方案

标准PCR实验方案

PCR操作方法

标准聚合酶链式反应 (PCR) 设置包括四个步骤:

  1. 向PCR管中添加所需的试剂或预混液和模板。
  2. 混合并离心。
    *添加矿物油可防止在无加热盖的热循环仪中蒸发。
  3. 按照热循环仪和引物参数扩增。
  4. 先后通过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色,评估扩增的DNA。
将PCR管载入热循环仪,进行PCR扩增步骤。

下面将详细介绍这些步骤以及对应的材料和试剂选择要点。以下为使用Taq DNA聚合酶进行的基本PCR方案。

PCR步骤和必要的PCR组分

PCR的反应的故障排除涉及到多个因素。观看此动画,了解如何根据需要选择正确的组分循环条件以帮助实现理想的效果。


关于用于其他聚合酶或进阶PCR技术的更多实验方案,请参见我们PCR技术指南的实验方案章节。

关于标准PCR的介绍等更多信息,请参见我们的PCR基础页面

试剂:PCR需要哪些试剂?

什么是Taq聚合酶?

Taq DNA聚合酶是一种来自嗜热细菌栖热水生菌的热稳定酶。其在PCR 常用于扩增DNA片段。该酶是重组形式,在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95°C(PCR技术强制要求)而不会显著损失活性。通过SDS-PAGE测定,该酶约为94 kDa,没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性以及5'→3'核酸外切酶活性。每批Taq DNA聚合酶都经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/μL供应,并配有优化的10x反应缓冲液。

标准Taq DNA聚合酶

请根据下表选择适合您反应条件的Taq  DNA聚合酶混合物。可选择有/无氯化镁(MgCl2)的透明或红色染料配方,预配制readymix,或包含缓冲液和dNTP的预混液。

单位定义:在74℃下,一单位可在30分钟内将10 nmol的总脱氧核糖核苷三磷酸酯结合到酸可沉淀的DNA中。

操作步骤:PCR步骤

Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物和MgCl2浓度的最佳条件取决于所用的系统。可能有必要确定每个单独组分的最佳条件。对于Taq DNA 聚合酶、循环参数和MgCl2浓度尤其如此。建议滴定酶和MgCl2以确定最佳效率。

  1. 按照表中给出的顺序将试剂添加到适当大小的试管中。(选择合适的反应设置表:标准试剂或预混试剂。)对于大规模反应,应设置不含模板的预混液,并将其等分到反应管中。最后,应将模板添加到适当的管中。

标准PCR反应

*可组合购买以下缓冲液和Taq 聚合酶:D1806、D4309或D4545

Readymix PCR反应

2.轻轻涡旋混合并短暂离心,收集试管底部的所有组分。

说明:如果使用没有加热盖的热循环仪,则向每个试管的顶部添加50 μL矿物油以防止蒸发。

3.扩增扩增参数会随所使用的引物和热循环仪的不同而不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪优化系统。

典型的循环参数

建议进行25-30个循环的扩增

4.扩增的DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色来评估。

      说明:可以通过单次氯仿提取(1:1)除去矿物油覆盖层,回收水相。

核酸电泳试剂

  • 琼脂糖(预制胶、粉末等形式)
  • 缓冲液,例如MOPS-EDTA-乙酸钠,tris-acetate-EDTA (TAE) 或tris-borate-EDTA(TBE)
  • 凝胶上样溶液和RNA上样缓冲液
  • 电泳染料或染料,如溴化乙锭
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