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标准 PCR 程序

如何进行 PCR

标准的聚合酶链反应（PCR）设置包括四个步骤：

  1. 在 PCR 管中加入所需的试剂或混合母液和模板。
    *在没有加热盖的热循环仪中加入矿物油以防止蒸发。
  2. 根据热循环仪和引物参数进行扩增。
  3. 通过琼脂糖凝胶电泳评估扩增的 DNA，然后进行溴化乙锭染色。
将 PCR 管装入热循环仪，进行 PCR 扩增步骤。

下面将详细介绍这些步骤以及材料和试剂选择技巧。这是一个使用 Taq DNA 聚合酶的基本 PCR 方案。

PCR 步骤和基本 PCR 组件

PCR 反应的故障排除涉及许多因素。观看本动画，了解根据您的需要选择正确的组件和循环条件如何有助于获得最佳结果。

在我们的《PCR 技术指南》的Protocols部分查找其他聚合酶或高级 PCR 技术的其他协议。

在我们的 Reagents：PCR 需要什么？

什么是 Taq Polymerase?

Taq DNA 聚合酶是一种来自嗜热细菌 水生hermus的恒温酶。 它 常用于在 PCR 中扩增 DNA 片段。这种酶是重组形式，在大肠杆菌中表达。它能经受反复加热至 95 °C（PCR 技术要求）而不会明显丧失活性。通过 SDS-PAGE 分析，该酶的分子量约为 94 kDa，没有检测到内切酶或外切酶活性。它具有 5'→3' DNA 聚合酶活性和 5'→3' 外切酶活性。每个批次的 Taq DNA 聚合酶都经过 PCR 扩增和双链测序测试。该酶的供应量为 5  单位/µL，并配有优化的 10 倍反应缓冲液。

标准 Taq DNA 聚合酶。DNA聚合酶

使用下表为您的反应条件选择合适的 Taq DNA聚合酶混合物。可选择含或不含氯化镁（MgCl2）的透明或红色染色配方，或预先准备好的预混液或含缓冲液和 dNTPs 的混合母液。

单位定义：一个单位在 74 °C、30 分钟内将 10 nmol 总脱氧核苷三磷酸酯结合到可酸析的 DNA 中。

程序：PCR 的步骤

Taq DNA 聚合酶、模板 DNA、引物和 MgCl2 浓度的最佳条件取决于所使用的系统。可能有必要确定每种成分的最佳条件。这尤其适用于 Taq DNA 聚合酶、循环参数和 MgCl2 浓度。建议对酶和 MgCl2 进行滴定，以确定最佳效率。

  1. 按表中提供的顺序将试剂加入适当大小的试管中。(对于大量反应，应配制不含模板的母液，并将其等分到反应管中。

标准 PCR 反应

。

*同时购买缓冲液和Taq聚合酶： D1806, D4309 或 D4545

Readymix PCR 反应

。

注意：如果使用无加热盖的热循环仪，在每支试管顶部加入 50 µL 矿物油以防蒸发。

3.扩增。扩增参数因引物和使用的热循环仪而异。

典型循环参数

建议扩增 25-30 个循环。

agarose gel electrophoresis and subsequent ethidium bromide staining.

      Note: Mineral oil overlay may be removed by a single chloroform extraction (1:1), recovering the aqueous phase.

核酸电泳试剂

  • 琼脂糖 （预制凝胶、粉末等）
  • 琼脂糖 （预制凝胶、粉末等）
  • 电泳染色剂或染料 如溴化乙锭
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