胃蛋白酶的酶法测定（3.4.23.1）

描述

本方法可用于以血红蛋白为底物的胃蛋白酶活性测定。这是一种分光光度速率终止测定法。

单位定义：一个单位的胃蛋白酶在37°C、pH 2.0 下，以血红蛋白作为底物，溶于三氯乙酸（TCA）的产物每分钟产生 0.001 的 ΔA₂₈₀ 。（最终体积 = 16 mL，光程 = 1 cm。）

所需试剂和设备

1.0 M 盐酸

牛血血红蛋白（货号：H2625）

6.1 N [~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液（货号：T0699）

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

10 mM HCl（盐酸）—— 用超纯水将 1.0 M 盐酸稀释 100 倍。

2.5% (w/v) 血红蛋白原液 – 使用牛血血红蛋白（货号：H2625）用超纯水配制 25 mg/mL 溶液。用力搅拌，形成漩涡，在37°C 下至少持续搅拌 10 分钟，然后用粗过滤器（90-130 mm）通过聚丙烯柱过滤。

底物[2.0% (w/v) 血红蛋白溶液]——将 80 mL 过滤后的 2.5% (w/v) 血红蛋白原液转移到合适的容器中。使用 5 M HCl 在 37°C 下将溶液的 pH调至 2.0。用超纯水将最终体积加至 100 mL。

TCA 溶液[5% (w/v) 三氯乙酸]——用超纯水稀释6.1 N[~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液（货号：T0699）20 倍。

酶溶液（胃蛋白酶）– 用冷的 (2-8°C) 10 mM HCl 制备 1 mg/mL 的原液。如果存在不溶物质，将原液置于冰上直至溶解。如果胃蛋白酶已经溶解，或者如果不溶性物质仍然存在，在 1 小时后，将 1 mg/mL 的原液用冷的10 mM HCl 溶液进一步稀释至 0.01–0.05 mg/mL。

操作流程

1.将底物移入合适的玻璃瓶中。

2.将小瓶置于恒温水浴中并平衡至 37°C 约 10 分钟，然后添加：

3.涡旋混合并在 37ºC孵育整整 10 分钟，然后添加：

4.涡旋混合并在 37°C 下再孵育5 分钟。  

5.通过 0.45 µm 注射过滤器过滤空白和试样混合物。使用分光光度计，记录每个小瓶中每种过滤溶液相对空气的A₂₈₀。

式中：

df = 稀释因子
10 = 以分钟计的测定孵育时间
1.0 = 添加的酶溶液体积 (ml)
0.001 =每单位胃蛋白酶（单位定义）的ΔA₂₈₀