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诱导多能干细胞培养实验方案

简介

诱导多能干细胞（iPSC）具有产生代表身体所有三个胚层的分化后代的能力：外胚层、内胚层和中胚层。有能力在体外扩增人iPSC并使其经受细胞类型特异性分化，对于产生源自患者的“器皿中的疾病”细胞模型，用于干细胞基础研究和新药开发应用是至关重要的。

本实验方案将给出详细的步骤，说明如何解冻、培养和深低温保存由欧洲诱导多能干细胞库（EBiSC）提供的人iPSC。人诱导多能干细胞（iPSC）系与任何其他已确立的细胞系不同。如果您不熟悉如何培养iPSC，请务必仔细阅读以下说明。

成功的关键点

  • 开始前请仔细阅读这些说明，包括所需试剂、解冻、传代、注意事项和故障排除提示等部分。
  • 在解冻细胞之前，确保已备好所有必需的试剂。
  • 使用正确匹配的培养基和基质。iPSC需要专门的培养基和培养条件。
  • 确保您的设备定期校准，且没有试剂过期。

方法

分析证书为在每种细胞系专用的培养基和基质中解冻细胞提出了建议。如果需要，所使用的基质和培养基只能在传代期间才能更换成替代品。在更换培养基或基质后，细胞可能需要时间来适应。如果不使用推荐的组织培养系统，则不能保证细胞活力或质量。

细胞外基质的制备

基底膜提取物（BME）的制备

干细胞合格的ECM凝胶基质（CC131）是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤中纯化的可溶性基底膜提取物（BME），其已被预先鉴定用于人ES/iPS细胞培养。基质在20-40°C下聚合，形成重构的基底膜。该产品含有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素等ECM。该基质省却了耗时的预筛选和批次识别的需要，为多能人ES/iPS细胞的长期培养提供了所需的优化ECM包被，并支持在多种无血清/无饲养层人ES/iPS扩增培养基（例如，mTeSR®、PluriSTEM™）中培养人ES/iPS细胞。以下是使用干细胞合格的ECM凝胶基质包被6孔板的一般指南。  所有操作程序均应在生物安全柜中的无菌条件下进行。

  1. 使用前一天，在2-8°C冰箱中解冻ECM凝胶基质（CC131）。解冻后，将ECM凝胶始终置于冰上，并使用预先冷却的培养基和移液器，以避免产品凝胶化。
  2. 用冷的DMEM/F12（D6421）培养基稀释ECM凝胶基质（CC131），稀释比例为1:80。  根据所需的体积按相应比例上调或下调。  以下是用1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶包被6孔板的示例。
    首先进行1:20稀释，操作步骤是，在15 mL锥形管中，将0.5 mL ECM凝胶加入9.5 mL冷的DMEM / F12或DMEM培养基中。  总体积 = 10 mL.
    需要进一步稀释4倍才能稀释成最终的1:80。  将2.5 mL 1:20稀释的ECM凝胶加入7.5 mL冷的DMEM / F12培养基中。  总体积 = 10 mL
    注意：建议的稀释度为1:80，但如果需要，可以使用更浓缩的干细胞合格ECM凝胶。
  3. 将1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶基质（CC131）加入6孔板的每个孔中。  涡旋培养板，以使ECM凝胶基质均匀地铺展在板的表面上。  使用前，将其存放在2-8°C的冰箱中冷藏过夜或至少2小时。  如果不立即使用，用保鲜膜将ECM包被的培养板包好，并储存于2-8 °C下直至准备使用。应在3-4天内使用ECM包被的培养板。
  4. 在接种细胞之前，将板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入3 mL人ES/iPSC生长培养基（SCM130）。现在可将细胞接种到新包被的平板上。

重要提示：  请勿让板干燥。

玻连蛋白的制备

  1. 玻连蛋白（CC130）在收到后应保存在-80°C。使用之前，在室温下解冻玻连蛋白原液小管，并在无菌聚丙烯管中制备60 μL等分试样。将等分试样冷冻保存在-80°C或立即使用。一个60 μL等分试样足以包被6孔板的所有孔。
  2. 如要制备0.5 μg/cm2工作浓度的玻连蛋白，将6 mL室温PBS（D8537）与60 μL玻连蛋白轻轻混合，以1:100比例稀释玻连蛋白。向6孔板的每个孔中加入1 mL稀释的玻连蛋白。
  3. 将包被的培养容器在室温下孵育1小时。如果需要储存，可以使用Parafilm® (P7793) 密封容器，并在2-8°C下储存最多3天。在使用前使容器平衡至室温1小时。
  4. 如要准备培养容器，从培养容器中取出多余的玻连蛋白并丢弃。除去玻连蛋白后不必洗涤培养容器。

细胞培养基制备

mTeSR™-1 培养基

  1. 需要时，从冰箱中取出mTeSR™1补剂（5x），并在使用前在2-8 °C下解冻过夜。请勿在37 °C下解冻。
  2. 在400 mL冷的（2-8 °C）基础培养基中无菌添加100 mL mTeSR™1 补剂（5x）。
  3. 将培养基等分成培养1周所需的体积。
  4. 全营养mTeSR™1在2-8 °C下可储存1周，在-20 °C下可储存6个月。冷冻的全营养mTeSR™1可以解冻一次。请勿反复冻融培养基。使用前，将mTeSR™1温热至室温。请勿将培养基在室温下放置超过每天2小时，并避免光照，以免培养基成分降解。

Essential 8™（TeSR™-E8）培养基

  1. 需要时，从冰箱中取出E8（50x），并在使用前在2-8°C下解冻过夜。请勿在37°C下解冻。
  2. 无菌取出10 mL E8基础培养基，留下490 mL。
  3. 向这490 mL冷的（2-8 °C）基础培养基中加入10 mL E8补剂（50x）。
  4. 将培养基等分成培养1周所需的体积。
  5. 全营养E8在2-8 °C下可储存1周，在-20 °C下可储存6个月。冷冻的全营养E8可以解冻一次。请勿反复冻融培养基。使用前，将E8温热至室温。请勿将培养基在室温下放置超过每天2小时，并避免光照，以免培养基成分降解。

PluriSTEM® 人ES/iPSC培养基

PluriSTEM®培养基 (SCM130, SCM132)是一种全营养小分子无血清培养基，可用于人ES / iPS细胞的无饲养层培养，可以每隔一天更换一次，而不会影响形态或长期功能。该培养基是全营养的，不需要进一步添加补剂。需要时，从冰箱中取出培养基，并在使用前在2-8°C下解冻过夜。请勿在37°C下解冻。解冻后，PluriSTEM®培养基应储存于2-8°C下，并在两周内使用。

 

人iPSC的解冻

  1. 应将冷冻管放在设置维持在37 °C的水浴中快速融化细胞。在水浴中轻轻涡旋冷冻管，以确保快速解冻，但请勿浸没冷冻管的盖子。打开前用70％乙醇(793213)或等效消毒剂对冷冻管进行消毒。
  2. 用5 mL无菌移液管，将冷冻保护剂 / 细胞混合物从冷冻管转移到15 mL离心管中。应注意不要对细胞造成物理损伤。
  3. 在室温下，缓慢地逐滴向15 mL离心管中的细胞中加入10 ml适当的培养基。轻轻前后摇动该15 mL离心管，同时加入几滴培养基。这是一个非常关键的步骤，可最大限度地减小对细胞的渗透冲击压，并且有助于确保尽可能温和地处理细胞。
  4. 检查试管以确保除去了所有细胞内容物。如果需要，用1 mL适用培养基冲洗。
  5. 少量细胞可用于进行细胞计数。应使用胰蛋白酶或其他合适的细胞分离培养基制成单细胞悬浮液。作为一般指导原则，6孔板的一孔接种密度范围介于2×105 - 1×106 个活细胞之间。对于任何特定批号的EBiSC细胞系，其相应的指南请参阅分析证书。
  6. 将细胞以200 x g离心2分钟。去除并倒掉上清液。
  7. 添加适量的培养基（例如，6孔板每孔1.5 - 2 mL）以准备培养容器。
  8. 轻拍15 mL离心管，以使细胞沉淀脱离，然后轻轻加入1 mL适当的培养基，并接种到包被的6孔板的2个孔中（如果使用其他培养形式，或者如果分析证书另有说明，则相应加以调整）。请勿过度吸取细胞，否则会因为单细胞悬液的生成而造成细胞活力下降。
  9. 轻轻左右和前后摇动板，以使细胞均匀铺展在整个孔中。
  10. 建议在解冻后立即、48小时、以及约达到70-80％汇合时，记录细胞图像。

 

人iPSC的培养

  1. 良好的作业规范是，在相差显微镜（4x、10x、20x和40x放大倍数）下每天观察iPSC细胞系，以检查iPSC样形态、分化细胞的存在和汇合。典型评分总结如下：
iPSC菌落的评分

图 1.iPSC菌落的评分

iPSC培养基中的分化水平

图 2.iPSC培养基中的分化水平

  1. 用吸移管从孔中除去约95％的培养基，以喂养细胞。请勿完全去除培养基，在细胞层上应覆盖薄薄一层培养基，以免细胞干燥。
  2. 对6孔板的每个孔，顺着孔的侧面轻轻地无菌添加2 mL新鲜培养基。将细胞置于37 ℃、5％ CO2培养箱中孵育。
  3. 通常，七天当中有六天是每天更换培养基，但如果细胞需要更长的培养基更换间隔时间，则需要增加培养基的体积（正常量的1.5x - 2x，取决于细胞密度）。更换培养基的间隔时间请勿超过两天。

人iPSC的传代

EZ-LiFT™ 试剂传代实验方案

  1. 开始之前，将EZ-LiFT™试剂(SCM139)温热至37°C。
  2. 吸除培养基，用1.5 mL EZ-LiFT™试剂(SCM139)洗涤孔两次。
  3. 向每孔加入1 mL EZ-LiFT™试剂(SCM139)。  将板在37°C下孵育4分钟。 
  4. 4分钟后，快速拍打板底部（即在5秒内拍打20-25次）。 
  5. 将平板放回37°C培养箱中再孵育4分钟。
  6. 4分钟后，快速拍打板底部（即在5秒内拍打20-25次）。
  7. 用显微镜快速检查孔。
    1.如果可以看到大量脱落的团块，则继续执行步骤8。
    2.如果没有观察到明显的脱落，则重复步骤4-7，除了在步骤5中，37°C孵育
    应该是2分钟而不是4分钟。  前往执行第8步。
  8. 轻轻收集细胞悬液（~1 mL），并转移至15 mL锥形管中。  将5 mL培养基轻轻地加入细胞悬液中以中和。  请勿上下移液，否则可能会将细胞团块破碎成单细胞悬液。
  9. 以800 rpm离心3分钟。吸除上清液。
  10. 轻轻地将细胞沉淀重悬于1 mL支持多能性的培养基中，例如PluriSTEM®(SCM130)。  请勿上下移液两次以上。  过度移液可能会造成分离成单细胞。 
  11. 将脱离的细胞团块传代至新包被的6孔板中。分割率应在1:6至1:30之间。每天监测细胞。取决于分割率，细胞通常在6-8天内达到60-80％汇合。

Accutase传代实验方案

  1. 等分足够的PluriSTEM®(SCM130)、Accutase (A6964)和DMEM/F12 (D6421)，以传代细胞。将试剂温热至室温。
  2. 在细胞传代前一小时，将ROCK抑制剂（ROCKi）Y-27632 (SCM075) 加入到6孔板的每个孔中，终浓度为10 μM。
  3. 1小时后，用解剖显微镜目视检查含有要传代的人多能细胞的平板。去除自发分化的区域。
  4. 从孔的刮擦区域吸出含有细胞的培养基。用2 mL DMEM/F-12 (D6421)培养基或1X PBS(D8537)冲洗每个孔。
  5. 吸干净6孔板的每个孔，然后每孔替换为1 mL Accutase (A6964)。在37°C孵育8-10分钟。
  6. 对所使用的每mL Accutase，添加1 mL PluriSTEM®培养基(SCM130) ，以淬灭Accutase反应。使用无菌1000 μL移液器吸头轻轻分离细胞。
  7. 将脱离后的细胞收集到15 mL锥形管中。用另外2 mL PluriSTEM® 培养基(SCM130)冲洗孔，以收集任何残留的细胞。将冲洗液加入到15 mL锥形管中。
  8. 在室温下，将含有细胞悬液的15 mL锥形管以300 × g离心5分钟。
  9. 吸除上清液。将细胞重悬于含有10 μM ROCK抑制剂Y-27632 (SCM130) 的新鲜PluriSTEM® 培养基(SCM075)中。
  10. 用Scepter™细胞计数仪或血细胞计数仪计数细胞数。确保细胞处于单细胞悬液中。使用台盼蓝(T8154)排除法确定细胞活力。
  11. 设置不同细胞密度的滴定，范围为0.5-1×104个细胞/cm2。这相当于含有10 μM ROCK抑制剂的PluriSTEM®培养基中，Matrigel包被的6孔板每孔50,000 - 100,000个细胞。
  12. 第二天，更换新鲜的PluriSTEM®培养基 (SCM130)。每2天更换一次新鲜的PluriSTEM®培养基 (SCM130) （每孔3 mL）。细胞可以每5-7天传代一次。

分散酶传代实验方案

  1. 等分足够的分散酶II 1 mg/mL (CC130)和DMEM/F12(D6421)，以传代细胞。将试剂温热至室温。
  2. 用解剖显微镜目视检查含有要传代的人多能细胞的平板。检查自发分化区域的菌落。
  3. 使用连接到p200自动移液器的无菌p200移液器吸头刮掉自发分化区域。
  4. 从孔的刮擦区域吸出含有细胞的培养基。用2 mL DMEM/F-12(D6421)培养基或1X PBS (D8537)冲洗每个孔。
  5. 在含有要传代的多能人ES或iPS细胞的6孔板的每孔中，加入1mL分散酶II 1 mg/mL (CC130)。
  6. 在37°C孵育6-7分钟。孵育后，在显微镜下目视检查菌落。菌落的边缘可能看起来远离板表面略微上翘和/或上翻，但是大部分菌落仍应附着在板上。
  7. 吸除分散酶II (CC130)，并用2 mL 1X PBS (D8537)或DMEM/F12 (D6421)培养基轻轻冲洗每个孔两次。
  8. 向每个孔中加入1.5-2 mL PluriSTEM®培养基 (SCM130) 。用细胞刮刀轻轻地分开菌落。
  9. 用5 mL血清移液管将细胞团收集到15 mL锥形管中。尽量减少上下移液，否则可能会将菌落破碎为不理想的小块。
  10. 用另外2 mL PluriSTEM®培养基 (SCM130)冲洗每个孔，以收集任何残留的细胞团。将冲洗液加入到15 mL锥形管中。
  11. 在室温下，将含有细胞团的15 mL锥形管以300 × g离心5分钟。
  12. 吸除上清液。将细胞团重悬于适当体积的PluriSTEM®培养基 (SCM130)中以进行传代。取决于细胞团的数量，将细胞分割成1:3至1:6。
  13. 将平板置于37oC培养箱中。轻轻地来回和左右摇动平板，以确保细胞团均匀地分布在孔的表面上。
  14. 第二天，每孔用3 mL新鲜的PluriSTEM®培养基 (SCM130)更换。细胞可以每5-7天传代一次。

人iPSC的深低温保存

  1. 在执行深低温保存操作程序的过程中，要保持试剂和冷冻容器（例如Mr. Frosty）处于低温。
  2. 细胞必须在其生长的对数期进行深低温保存，以提高解冻后的存活率。收获的最佳时间通常是细胞达到约70-80％汇合时。
  3. 所使用的冷冻保护剂类型取决于培养条件和实验室偏好。使用基于市售的Cryostor®  CS10 (C2874)或DMSO (D2650)的冷冻混合液（FBS和培养基中含10％ DMSO）。Cryostor®培养基可直接使用并保存在2-8°C。为制备基于DMSO的冷冻保护剂，将40％ FBS与10％ DMSO混合，然后与50％适当的培养基混合。
  4. 从组织培养容器中取出用过的培养基，并根据培养条件用推荐体积的洗涤缓冲液洗涤容器两次（Cultrex / Matrigel的洗涤缓冲液是0.5 mM EDTA，玻连蛋白的洗涤缓冲液是PBS）。
  5. 为了使细胞脱离组织培养塑料表面，将 1mL 0.5 mM EDTA (03690) 加入到组织培养容器中。根据所使用的基质，在建议的温度下，将细胞孵育建议的时间长度。从孔中吸除EDTA。必须小心，因为菌落非常松地附着在塑料上。
  6. 在每孔中加入1 mL冷冻保护剂。用1 mL无菌移液管轻轻冲洗容器上的冷冻保护剂，使细胞脱离塑料表面。请勿吸移超过3次，以免细胞团破碎成单个细胞。将冷冻保护剂和细胞混合液放入适当标记的冷冻管中。
  7. 如果需要深低温保存更多的孔，应将来自相同传代数和培养条件的细胞合并在一起。然后等分混合后的细胞，可用于细胞计数。将收获的细胞以200 x g离心2分钟，吸除用过的培养基，并将细胞沉淀轻轻地重悬于适当体积的冷冻保护剂中。6孔板的一个孔产生约1-2 × 106个细胞。建议每个冷冻管冷冻约1-2 × 106个细胞。每个冷冻管使用1 mL冷冻保护剂-细胞混合液。
  8. 立即将冷冻管放入预冷（2-8°C）的Mr. Frosty水浴中，然后立即将Mr. Frosty水浴转移到-80°C的冰箱中。让细胞在-80°C过夜（16-36小时）。冷冻后，将细胞置于干冰上转移至超低温储存容器（液氮或-150°C冰箱）。

人iPSC的表征

iPSC未分化状态的特征在于碱性磷酸酶(SCR004)和干细胞转录因子Nanog、Oct-4和Sox-2的高度表达。这些细胞在其阶段特异性胚胎抗原（SSEA1、3、4）和足细胞标记蛋白（TRA-1-60，TRA-1-81）标记物的表达方面，也显示出与它们的鼠对应物的显著差异。可以使用高细胞表征试剂盒(SCR001, SCR002, SCR078)进行抗体ICC染色或通过PCR分析方法来分析细胞。

表1.人iPSC标记物汇总
多能 iPS细胞表达多能性标志物。

图 3.多能 iPS细胞表达多能性标志物。碱性磷酸酶 (40x) (A), Oct-4 Alexa 488 (MAB4401A4, 400x) (B), Sox-2 Cy3 (MAB4423C3, 100x) (C), Nanog Alexa 488 (MABD24A4, 400x) (D), TRA-1-60 Cy3 (MAB4360C3, 100x) (E), 以及TRA-1-81-Cy3 (MAB4381C3, 100x) (F)。细胞核用DAPI（蓝色）（D9542）复染。

 

故障排除提示

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