简介
方法
使用非整合的自我复制RNA载体重编程人成纤维细胞
使用STEMCCA慢病毒载体重编程外周血单个核细胞(PBMC)
重编程iPSC集落的表征和拣选
常问问题
材料
诱导多能干细胞(iPSC)的现成来源对于分化途径的有效研究以及iPS细胞的治疗潜力的研究是至关重要的。自从发现通过诱导四种重编程因子(OCT-4、SOX-2、KLF-4和c-MYC)的表达可以产生人类iPSC之后1,出现了许多不同的生成iPSC的重编程技术,每种都具有自身优点和缺点2。
基于逆转录病毒和慢病毒系统的第一代技术实现了高效的重编程事件,但缺乏对宿主基因组整合的必要控制。Cre可切除的慢病毒系统提供了基因组整合的解决方案,但需要冗长的亚克隆程序和筛选以确保切除重编程因子。
第二代技术使用非整合游离DNA质粒,这些质粒不含转基因,但缺乏早期逆转录病毒和慢病毒技术的重编程高效率。第三代技术使用负义、非整合RNA病毒,称为仙台病毒(SeV),其源自于小鼠、仓鼠、豚鼠、大鼠和猪的高度传染性呼吸道感染。这些RNA病毒产生无整合的iPSC,且重编程效率高,易于使用,但残留的仙台病毒难以从细胞中清除,导致需要多轮克隆扩增和分析。
使用专门设计的合成的自我复制RNA模拟细胞RNA的下一代重编程系统已被用于产生人iPS细胞3。单个RNA链含有四个重编程因子,使用单个转染步骤即可实现极其有效的重编程,而无需任何病毒中间体或宿主基因组整合。产生iPSC后,通过从细胞培养基中除去干扰素-γ(IFNg)抑制剂B18R,即可容易地选择性地消除RNA。
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图 1.重编程方法的演变。重编程技术的演变,最终导致开发出合成RNA介导的重编程(最右边),它代表了最安全和最有效的iPS细胞生成方法:Simplicon™ RNA重编程技术将逆转录病毒和慢病毒重编程技术的效率与基于非病毒的重编程方法的安全性融为一体。
图 2.Simplicon RNA人HFF重编程时间表。使用自我复制RNA的单次转染可以在执行3-4周的实验方案后产生大量无整合的iPSC。
图 3.使用人Simplicon RNA重编程试剂盒产生人iPSC集落的时间过程。在第10天,将转染的HFF重新接种到无活性的MEF上,从第15-16天开始出现集落,并且在第17-20天左右更明显(A、B)。在第26天即可采摘集落。
最近的研究结果表明,完全重编程的人iPS细胞具有以下特征:(1)它们下调成纤维细胞标记物CD13的表达;(2)它们上调多能标记物SSEA-4和TRA-1-60的表达;(3)它们抑制病毒转基因,与此同时(4)重新激活Nanog的内源性表达;(5)它们呈现HoeschstDim表型。这些特征使得能够从部分重编程细胞的混合群体中可靠地鉴定和拣选出完全重编程的人iPS细胞。
密理博的人iPS选择试剂盒(SCR502)是一种快速、简便且无创的方法,可使用免疫细胞化学(ICC)监测完全重编程的人iPS细胞的多能状态。使用人iPS选择试剂盒可进行活细胞成像,及从异质的重编程中间体群体中鉴别出完全重编程的人iPS细胞,并且能够选择出可以进一步传代和扩增用于下游应用的人iPS细胞。
图 4.完全重编程的人iPS细胞表达人多能标记物TRA-1-60 FITC(D、E、G、H,绿色)和SSEA-4 PE(C、F、G、H,红色),同时下调成纤维细胞标记物CD13 PE(数据未显示)。图中细胞是用可渗透细胞的Hoechst核染料(B、C、D、H,蓝色)染色。完全重编程的人iPS细胞表现出Hoechst暗淡表型(参见B、C、D、H中的集落中心),而非iPS和分化细胞则表现出Hoechst亮表型(参见B、C、D、H中集落的外围,它被成纤维细胞包围,并且Hoechst染色明亮)。第5代人iPS集落用于活染色。
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