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mRNA疫苗和治疗制剂生产策略

Laurens Vergauwen, Process Development Scientist, Nargisse El Hajjami, Associate Director Cell and Gene Therapy Segment, Manuel Brantner, Associate Director Vaccine and Plasma Segment, Shiksha Mantri, Global Marketing Manager mRNA Applications, Bahar Cebi, Segment Marketing Manager Novel Modalities & Vaccines

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病毒递送系统(如AAV腺相关病毒载体)较为成熟,已经获批用作疫苗和基因治疗制剂的载体。病毒类载体尽管使用广泛却具有免疫原性,会引起比其他制剂更为频繁的系统性副反应。此外,其生产工艺较为复杂,在基因治疗应用中有高滴度要求。

而非病毒递送系统预期安全性更高,生产工艺更简单,有望成为模式化工艺。

mRNA技术采用非病毒递送系统,具有极高的多样性。将mRNA递送到细胞的胞质溶胶中可诱导目的蛋白表达,发挥治疗性或预防性作用,作为抗原刺激机体产生免疫反应获得免疫保护,替代有缺陷的蛋白功能或激活抗肿瘤反应。

三种新冠(SARS-CoV-2)mRNA疫苗的强效和快速表现预示mRNA技术的意义远超当前的抗疫需要,未来还可采用类似的疗法对抗癌症、心脏病和其他传染病。

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mRNA生产考量

mRNA(信使RNA)药物和疫苗的开发和生产相对简单、可扩大化且极为快速(图1)。mRNA技术缩短了从开发到临床和获批的进程,不仅适合应对传染病和大流行疫情,也适合用于开发新疗法解决未获满足的疾病医疗需求。

mRNA通过酶促工艺在体外合成,与需要进行耗时繁琐的克隆和扩增的传统体内蛋白表达工艺存在明显的区别。体外合成还有一个优势,就是无需去除细胞或宿主细胞残留蛋白。采用这种简化的生产工艺,可使用相同的反应材料和容器生产任一靶标——仅需对工艺和配方稍作调整,即可迅速改造成生产新目的蛋白的GMP设施。

mRNA一般生产工艺概览

图 1.mRNA一般生产工艺概览

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mRNA制备

mRNA药物和疫苗的生产通常从质粒DNA(pDNA)模板开始,模板含有DNA依赖性RNA聚合酶启动子和mRNA构建体的相应序列。鉴于pDNA序列的中心地位,它的设计和纯度是mRNA产品优化的重要考虑因素。pDNA因核酸的高分子量和高粘性、剪切敏感性以及产物和杂质之间的相似性,为生产和纯化带来诸多挑战。克服这些挑战的策略详见我们的《质粒DNA可扩大化纯化》(Scalable purification of Plasmid DNA)一文。

mRNA构建体设计要保证目的基因高效表达。稳定性、基因表达和高效的蛋白翻译受多个结构元件影响(图2):

mRNA结构

图 2.mRNA结构

  • 序列5’端的帽子结构是成熟mRNA的必备条件,便于核糖体识别mRNA进行高效的蛋白翻译。帽子也具有保护mRNA防止其被核酸酶消化的稳定作用。
  • 非翻译区(UTR)位于mRNA编码区的上游和下游结构域,影响翻译效率、定位和稳定性,可用于提高蛋白表达。
  • 开放阅读框(ORF)或编码序列区含有靶基因(GOI)。
  • 多聚腺苷酸尾巴poly-(A)防止3’外切酶消化,对于蛋白翻译和mRNA稳定性均十分重要。

符合要求的pDNA在细菌细胞内(通常为大肠杆菌)扩增建库,接着纯化得到浓缩的环状纯pDNA。pDNA接着线性化,作为模板通过RNA聚合酶介导的转录合成所需mRNA。

线性化是为了防止转录通读生成非必要的mRNA,成为需要去除的杂质。将质粒DNA与限制性内切酶(溶于反应缓冲液)混合4,接着在37 °C孵育4小时,可完成线性化。加入EDTA或65 °C热灭活均可终止反应。

然后纯化去除限制性酶、BSA、DNA片段、内毒素等杂质。对于这一纯化步骤,大多数实验室规模的工艺采用溶剂萃取技术,不适用于GMP生产。

作为替代,可改用切向流过滤(TFF)和色谱技术高效去除杂质。

下一步是体外转录,即以线性化pDNA为模板转录合成mRNA。这一酶促反应采用天然转录工具,包括RNA聚合酶和核苷三磷酸。转录后,未成熟mRNA需要在5’端加上帽子,加强其在细胞中的稳定性和转导效率。

加帽有共转录和酶法两种方式。共转录加帽通常将帽类似物和鸟苷三磷酸(GTP)按4:1的比例添加到转录混合物中。接着进行37 °C孵育,通常添加DNA酶消化DNA模板;通过切向流过滤(TFF)可将产生的DNA小片段与较大的mRNA分子轻松分离。另一种去除DNA模板的方法是色谱法(比如Poly (dT)捕获)。采用这种方法DNA模板不会被消化,因而可避免生成的小分子DNA片段与mRNA杂交。4

共转录加帽与转录同时进行,使用相同的反应混合液,因此相比酶法加帽更加便宜和快速。但效率和产率更低,并会生成未加帽杂质,因为GTP除了结合帽类似物,还会结合mRNA序列。此外,帽类似物还会反向掺入mRNA。为了解决这一问题,研发了一些反逆转录帽类似物(ARCA),用于防止5’帽的反向加入,使翻译效率更高。

酶法加帽在mRNA从体外转录混合液中纯化后进行。通常采用痘苗病毒加帽酶在mRNA结构上加帽。虽然酶法加帽效率更高,但更为昂贵,并且多一步操作。

mRNA纯化

完成体外转录之后, 将所得mRNA从上一步骤中的杂质和所用材料中纯化出来,包括内毒素、免疫原性双链RNA(dsRNA)、残留DNA模板、RNA聚合酶和元素杂质。mRNA纯化有多种方式可供选择。

切向流过滤(TFF)可将mRNA与穿膜的小分子杂质高效分离;根据mRNA大小可选择30-300 kDa的截留分子量。TFF技术方便我们在相同的单元操作中进行产品的纯化、浓缩和洗滤。在这一阶段,需要采用适合酶法加帽或色谱分离的适当缓冲液。使用TFF时有一点要特别注意,小分子DNA片段会与mRNA杂交产生额外的杂质。根据过往经验,如果使用捕获法去除DNA模板就不会有这种风险。5

多种色谱技术可替代TFF,包括反相离子对色谱、阴离子交换色谱和采用poly(dT)捕获的亲和色谱(表1)。

mRNA纯化用反相离子对色谱、阴离子交换色谱和亲和色谱技术比较。DBC:动态吸附载量。

表1.mRNA纯化用反相离子对色谱、阴离子交换色谱和亲和色谱技术比较。DBC:动态吸附载量。3,4

色谱法可高效的去除DNA模板,并且避免了超滤/洗滤(diafiltration)中会发生的杂交风险。但它也更加昂贵,并且仍需要TFF步骤进行介质置换并为后续步骤做好准备。

色谱法也用于去除前一步酶反应中生成的不需要产物和寡核苷酸杂质,以便进行酶法加帽反应。

反相离子对色谱常用于小规模纯化,可快速高效地纯化RNA,可从DNA、双链RNA(dsRNA)和短链转录本中较好地分离单链RNA(ssRNA)。但这种方法需要使用溶剂,非常不适合用于GMP生产。它还需要离子对试剂,会与mRNA形成复合物,可能需要大量的洗滤步骤才能去除。另外,它极易被蛋白质和聚集物堵塞,因而相比用于捕获更适合用于精制。

阴离子交换色谱具有较高的动态吸附载量,可极其高效地去除免疫原性杂质,如dsRNA、未加帽RNA、RNA-DNA杂交体等RNA。虽然它可使用水溶性溶液,但可能还需要添加有毒的离液盐,并要在高达85°C的温度下操作以洗脱吸附在树脂上的mRNA大分子。室温操作通常只能洗脱500碱基以下的mRNA分子。3

poly(dT)捕获法亲和色谱通过树脂特异性捕获mRNA全长转录本的poly(A)尾。该法可高效去除DNA、核苷酸、酶、缓冲液组分等任何不含poly(A)尾的杂质。

它的缺点在于,不像反相和阴离子交换法一样分开双链RNA和单链RNA。此外,产品相关poly(dT)不能有效去除其他产品相关杂质,如与mRNA杂交的DNA片段。因此,通常会在亲和色谱纯化之后再进行阴离子交换色谱进一步精制。

在色谱步骤之后,进行最终浓缩和洗滤以最大程度提高纯度,然后将mRNA转移到适当的缓冲液中进行后续的配制或储存。在这个阶段,可在相同的单元操作中进一步进行mRNA的纯化、浓缩和洗滤。 完成这一切向流过滤步骤后,还可继续进行无菌过滤。然而需要注意的是,5000 kDa分子量或更大的mRNA分子的除菌级过滤将极具挑战。

mRNA制剂

递送工具对于mRNA疫苗和药物的有效性同样重要。完成最后的mRNA纯化步骤之后,下一步需要考虑的是递送方法(图3)。目前最先进的一类递送系统是基于脂质或聚合物。包括寡聚核苷酸与脂质结合形成核酸脂质复合物(lipoplex),或与阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺(PEI))复合(polyplex)。

脂质纳米颗粒(LNP)是最常用的mRNA递送系统,每种脂质纳米颗粒都包含四种不同的脂质成分,用于裹送mRNA并保护其免遭降解。

其中阳离子/离子化脂质用于通过静电作用包封RNA。将mRNA递送到肝细胞(用于激活或沉默蛋白表达)中需要离子化脂质(被动靶向,内体释放),而免疫细胞摄取则容易很多。也可使用强阳离子脂质。

有多种mRNA递送系统可供选择。

图 3.有多种mRNA递送系统可供选择。

这种脂质也负责将RNA高效地释放到细胞质中。阳离子脂质的结构对LNP的活性有较大影响,它的毒性和生物分布会影响颗粒在机体内的潜在毒性作用。

聚乙二醇(PEG)化脂质可稳定胶态,并防止蛋白吸附到纳米颗粒上,因此保护其免遭免疫系统攻击,延长血液循环时间。PEG的链长和脂肪酸链决定LNP的循环寿命和融合性(或颗粒与内体膜的融合情况)。如需延长循环时间,可采用更长的脂肪酸链,比如二硬脂酰甘油-聚乙二醇(DSG PEG 2000)。PEG的浓度也影响纳米颗粒的大小。此外,PEG可能会导致抗PEG抗体的产生,从而有可能因为免疫系统而失去作用。

中性/阴离子脂质可稳定颗粒结构,影响融合性和生物分布。二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine)。例如,最近有研究1显示,LNP中所含二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine, DOPE)在内体释放中起重要作用,相比二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC),更能加强mRNA的肝递送。最近研究2表明,这些辅助脂质也有助于增强RNA包封的稳定性。

胆固醇用于调节LNP的脂双层密度、流动性和摄取(脂筏形成)。市售胆固醇分为动物源和人工合成两种,相较之下,合成胆固醇具有纯度更高、不含动物源分子(如朊病毒)、工艺可扩大化、高度稳定等优势。

脂质选择考虑因素选择脂质时应考虑递送路径,以便获得最高效力和最佳生物分布。除了选择脂质种类外,各脂质的比例也是重要的选择因素,因为它对LNP的脂双层流动性和融合性具有直接影响。

选择脂质时,有几个关键因素需要考虑。脂质的种类、来源和质量对杂质谱以及纳米颗粒特性、稳定性和最终制剂的释放性能等性质有直接影响。为了保证最终制剂的重现性结果,脂质需要保持质量的一致性,这取决于合成脂质所用原料的质量以及脂质本身材料特性的适宜性。

纯化mRNA可通过不同技术包封到递送颗粒中而制成制剂。在常用的溶剂注入法中,脂质溶解在乙醇等溶剂中,通过层流混合或微流控混合与含有mRNA的低pH缓冲水溶液快速混合而成LNP。接着将低pH缓冲液洗滤成中性缓冲液,并通过超滤浓缩纳米颗粒。

TFF步骤必须尽快进行,因为脂质在低pH下会水解,形成水脂(hydrolipid)等杂质,影响脂双层结构、制剂稳定性和药物释放特征。脂质降解还能增加粒径大小,导致聚集。

脂质纳米颗粒具有十分优秀的稳定性、结构可塑性,相比其他递送体系更擅长基因递送。相比裸露的mRNA,它可提高mRNA的转染率,静脉注射后不用担心mRNA会被血流中的RNA酶降解,如果加入特定的配体还能实现主动靶向。

脂质纳米颗粒的劣势之一是它可能需要冷链物流。此外,某些情况下,LNP可能无法进行无菌过滤,需要考虑伽马辐照、热灭菌、高压灭菌和封闭工艺等替代方法。

如需详细了解mRNA制剂及其相关的关键参数和考虑因素,请浏览我们的网络研讨会:基于脂质的RNA递送制剂成功开发关键("Key to Successful Formulation Development for Lipid Based RNA Delivery”)。

工艺放大考量

放大mRNA生产工艺时,有几项要点需要注意,在进行小规模的工艺开发时,应将这些要点摆在首要位置。

  • 采用溶剂萃取和沉淀法的mRNA纯化步骤不易放大,并且使用的有害溶剂不适合GMP环境,可用TFF或色谱法替代。
  • 由于RNA酶能在数秒内降解mRNA,所有能接触产品的原料、溶液和设备都不能含有这种酶。
  • 适合的递送系统可提高疫苗或药物的效力,应仔细选择。
  • 如果最终的成品是大分子mRNA复合体,应考虑产品无菌过滤的替代方法。
  • 额外的供应链要求(如冷链)严重影响成本。因此,应对药物的稳定性进行仔细评估。

前景可期

mRNA技术为新冠(COVID-19)候选疫苗研发带来前所未有的速度和出色的有效率。展望未来,这项技术不仅凭借对爆发疾病的快速响应而革新疫苗研发领域,还能通过基因疗法解决未获满足的疾病治疗需求。

mRNA有望成为快速而灵活的疫苗平台;如今疫苗研发已不再是科研难题,可以专注于工艺开发。一旦弄清病原体的基因序列,疫苗企业就能相对快速地设计出mRNA疫苗。为了充分发挥这种疗法的潜力,需要汇聚创新解决方案、专业技能和聪明才智建立简单而强大的生产规模平台。同时还需要评估研发的mRNA构建体和递送体系的安全性、有效性、质量和工艺性。

解决这些挑战之后,基于mRNA的疫苗和药物将跻身先进疗法之列,为全世界病患带来显著疗效。

参考文献

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Kulkarni JA, Witzigmann D, Leung J, Tam YYC, Cullis PR. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. 11(45):21733-21739. https://doi.org/10.1039/c9nr09347h
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