mRNA疫苗和治疗药物的生产策略

mRNA生产的主要考虑因素有哪些？

mRNA疫苗和治疗药物的生产通常遵循一种模板化流程（图1）。这种简化的生产模板针对任何靶标均使用相同的反应原料，使mRNA制造商能够仅需极少的工艺调整即可生产新的靶标分子。

有几项关键决策对最终mRNA产品的工艺、收率和质量有着巨大影响，其中之一便是工艺化学品和原材料的质量。特别是在体外转录和下游纯化过程中，mRNA处于无保护状态，面临较高的酶降解风险。使用经过内切核酸酶活性检测的高质量化学品，可最大限度地降低RNase诱导的降解风险，并提高mRNA在整个纯化及mRNA药物制剂制备过程中的稳定性。

本网页将通过介绍我们专为优化您的mRNA生产流程而设计的全面、集成化解决方案，帮助您应对这些及其他挑战。我们的宣传册《mRNA药物生产用工艺化学品》提供了您做出明智决策所需的详细信息。

关键要点

• mRNA 生产主要遵循模板化流程，但原材料质量、适当纯化技术的选择以及关键工艺参数的控制，都会显著影响 mRNA 的产率、稳定性和最终产品质量。
• 无内切酶的化学品和高质量的工艺材料有助于最大限度地减少体外转录、下游纯化和制剂过程中由 RNase 引起的降解。
• 色谱法可实现可扩展的mRNA纯化，并用于去除残留DNA、双链RNA、残留酶及工艺相关杂质。结合多种方法可实现高效纯化。
• 一次性技术可成为 mRNA 制造的关键推动力，因为它具有可扩展性、适应性、高质量，并且具有跨多种 mRNA 疫苗和治疗应用的灵活性。
• 规模扩大通常涉及用适合大规模生产的方法取代小规模方法，例如适用于高效大规模分离的TFF和色谱法。

mRNA：结构元件及其功能

mRNA构建体的设计旨在确保目标基因的高效表达。其稳定性、基因表达以及高效的蛋白质翻译均取决于若干结构元件（图2）：

• 序列5’端的首端区域（Cap region）：对mRNA成熟、被核糖体识别以实现高效的蛋白质翻译，以及防止被核酸酶降解以提高稳定性至关重要。
• mRNA编码区上游和下游的未翻译区（UTRs）：调控mRNA的翻译、定位和稳定性；可用于提高蛋白质表达效率。
• 开放阅读框或编码序列区域：包含目标基因（GOI）。
• 聚(A)尾：通过防止3’外切酶的消化，对蛋白质翻译和mRNA的稳定性至关重要。

mRNA的制备

基于mRNA的治疗药物和疫苗的生产始于质粒DNA（pDNA）模板，该模板随后被线性化并转录为mRNA。

• 质粒DNA（pDNA）制备：pDNA模板包含DNA依赖性RNA聚合酶启动子以及mRNA构建体的序列。pDNA在细菌细胞内扩增，随后收集并裂解细菌细胞以释放环状pDNA。该裂解液粘度极高，因为其中不仅含有pDNA，还含有其他大分子负电荷杂质，例如RNA、基因组DNA以及来自细菌细胞的内毒素，这使得纯化过程颇具挑战性。
• pDNA纯化：从杂质中纯化pDNA模板时，应最大限度地实现分离，同时尽量减少对质粒模板的机械损伤。 随后，将纯化的环状pDNA线性化，以避免转录穿透现象——该现象可能产生需要去除的非预期mRNA序列变体。^¹ 该线性化pDNA模板需进一步纯化，以去除用于线性化的限制性内切酶、牛血清白蛋白（BSA）、DNA片段及内毒素等杂质。 由于 pDNA 模板通常在细菌细胞中产生，内毒素杂质是影响后续纯化步骤的关键杂质。Deviron® C16 等表面活性剂可有效去除内毒素，且作为传统表面活性剂的替代品，具有可持续、可生物降解且符合 REACH 法规的特点。²

实验室规模与 GMP 生产规模在 pDNA 纯化方法上存在显著差异。实验室规模工艺通常采用溶剂萃取技术将 pDNA 与其他组分分离，但在大规模生产中，这些化学品的处理和处置可能面临挑战。相比之下，GMP 生产环境通常采用切向流过滤（TFF）和色谱法来高效去除杂质。 

体外转录（IVT）：经线性化和纯化的质粒DNA随后通过酶促反应转录为mRNA。

• 体外转录的关键组分包括：催化DNA转录为mRNA的RNA聚合酶；作为mRNA构建模块的核苷三磷酸（rNTPs）；可提高mRNA产量的无机焦磷酸酶（IPP）；以及防止RNA降解的RNase抑制剂。 转录缓冲液通常含有二硫苏糖醇（DTT），用于还原二硫键并抑制核糖核酸酶活性；同时加入精胺以提高转录效率并稳定核酸。为了最大限度地降低这一关键工艺步骤中酶降解的风险，必须选择经过测试、确认不含内切核酸酶活性的化学品。 如需全面了解我们高品质的化学品和辅料（包括种类丰富的无内切核酸酶产品组合），请查阅我们的宣传册《mRNA药物生产用工艺化学品》。
• 转录监测：在体外转录（IVT）反应过程中，应监测关键工艺参数（CPPs），以控制关键质量属性（CQAs）并确保最佳加工效果。有效的监测有助于实现更可控的生产，并能更快地应对工艺变异性。

加帽：转录完成后，需在mRNA转录本上添加5’加帽结构，以提高其在宿主细胞中的稳定性和转导效率。加帽可通过以下两种方式进行：

• 转录共加帽：在IVT步骤中进行。但该方法效率和收率较低，且可能因结合错误或反向整合而产生未加帽的杂质。
• 酶促加帽（或称翻译后加帽）在mRNA纯化后进行。该方法通常使用加帽酶将帽结构添加到纯化的mRNA上。虽然该方法效率更高，但成本更高，且是纯化后的额外处理步骤。

mRNA的纯化

体外转录完成后，需从mRNA中纯化去除前几步操作中产生的杂质和残留物质，包括内毒素、具有免疫原性的双链RNA（dsRNA）、残留DNA模板、RNA聚合酶以及元素杂质。目前有多种方法可用于mRNA的纯化及残留DNA的去除。

色谱分离方法（如反相离子对色谱（IPRP）、阴离子交换色谱（AEX）以及利用聚（dT）捕获的亲和色谱（AC））（图3）能够高效纯化目标mRNA并去除DNA模板，从而无需进行DNA消化^¹，³。在酶促加帽反应后，也会使用色谱法去除不需要的mRNA转录本和寡核苷酸杂质。

• 反相离子配对色谱（IPRP）可在小规模条件下高效捕获目标单链RNA（ssRNA）并将其与杂质分离。然而，由于该方法需要使用溶剂，因此不太适合GMP生产，且更适用于纯化而非捕获。
• 阴离子交换（AEX）色谱具有较高的动态结合容量，可高效去除双链RNA（dsRNA）、无帽RNA、RNA-DNA杂合体以及发夹mRNA等其他RNA结构。虽然AEX使用水溶液，但需要使用潜在有毒的扰乱剂，且操作温度高达85 °C，才能将结合在树脂上的大分子mRNA脱附出来。
• 亲和色谱（AC）聚（dT）捕获法利用树脂特异性捕获全长mRNA转录本的聚（A）尾。该方法可高效去除DNA、核苷酸、酶、缓冲液组分以及任何其他不具有聚（A）尾的杂质。因此，AC通常用于初始mRNA捕获，随后采用AEX进行纯化。
• 色谱步骤完成后，将进行最终浓缩和透析，以最大限度地提高产物纯度，并将mRNA转移至适合制剂或储存的缓冲液中。

规模化生产注意事项

对于拥有大量目标产品管线的制造商而言，一次性技术具有可扩展性、适应性和质量保障，是许多mRNA GMP生产工艺的关键推动力。GMP生产利用TFF或色谱步骤的优势进行高效的大规模分离，取代了小规模工艺开发中常见的替代性纯化方法。需要注意的考虑因素包括：

• TFF 或色谱步骤取代了 mRNA 工艺开发中常用的溶剂萃取和沉淀步骤。
• 应尽可能使用高品质化学品和无内切酶试剂，以提高mRNA的稳定性并最大限度地降低mRNA降解的可能性。

近年来，mRNA疫苗在面向大规模患者群体的推广方面取得了重大成功。尽管仍面临挑战，但通过使用高品质化学品和无内切酶试剂来最大限度地提高mRNA稳定性，以及优化和定制色谱纯化技术以实现最佳分离并简化规模放大，这些举措已使GMP生产模板取得了重大进展。

为确保mRNA技术充分发挥其潜力，需要创新的解决方案、专业知识和独创性，以帮助稳健的平台在生产规模上不断演进。凭借我们的产品、服务和技术专长，我们致力于开发集成解决方案，以优化您的mRNA生产流程。

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