Southern Blotting实验方法
Northern Blotting实验方案
核酸与蛋白质等大分子向固相支撑膜的转移称为印迹。通过凝胶电泳分离的DNA和RNA分子的片段分别在称为Southern和Northern印迹的过程中转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。Southern印迹由Edwin Southern于1975年推出,是一种检测DNA样品中特定DNA序列的方法。基于该方法出现的其他印迹技术被称为Northern印迹(用于RNA)、Western印迹(用于蛋白质)、Eastern印迹(用于翻译后蛋白质修饰)和Southwestern印迹(用于DNA-蛋白质相互作用)。
Southern和Northern印迹实验方案包括以下主要步骤:
图 1.DNA/RNA印迹操作程序中的步骤
*PerfectHyb™ Plus杂交缓冲液(H7033)可用来代替Denhardt、预杂交和杂交溶液。PerfectHyb™ 缓冲液经过优化,可在短至1-2小时的杂交中产生最大信号,且背景最小。PerfectHyb™ Plus配方适用于使用任何类型的探针、以及在任何类型的膜(带正电或中性尼龙和硝酸纤维素)上进行的任何杂交实验方案。
Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒,用于从植物和真菌 (E5038)、哺乳动物细胞或组织 (G1N70, G1N10 和 G1N350) 、以及血液(NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。可以在这里找到使用GenElute™试剂盒进行DNA分离的详细实验方案。
此外,DNAstable® 试剂盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定。
用适当的限制性酶在37 °C消化DNA 2-24 h。如果DNA样品是克隆衍生产物,则1-2小时的消化时间就足够了。对于基因组DNA,通常需要用过量的酶(5-10X)孵育过夜。
如有必要,使用乙醇沉淀法浓缩消化的DNA。在凝胶上分离之前,必须完全除去痕量乙醇。
在琼脂糖凝胶上溶解消化的DNA。TAE应该用于较短时间的运行(<4小时)和较大的DNA片段,而TBE应该用于较长时间的运行(> 4小时)和较小的DNA片段(<1kb)。或者使用Bionic™缓冲液(B6185)在比TAE或TBE更短的时间内获得更清晰的条带分辨率(有关更多信息,请参见Bionic™缓冲液数据)。用溴化乙锭染色凝胶,并使用UV透照仪获得凝胶图像。如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中,则可以在运行后立即获得凝胶图像。
在转膜步骤中,来自电泳凝胶的DNA(或RNA)将被转移到尼龙膜上,以使探针易于杂交和检测。
图 2.Southern/northern blot转膜组件
预杂交(也称为封闭)步骤的作用是最大限度地减少探针对尼龙膜的非特异性附着。鲑鱼精子DNA通常用作封闭剂,用来防止探针粘附到膜上,确保它只与已经转移到膜上的目标DNA条带相互作用。按如下步骤制备预杂交溶液或使用PerfectHyb™ Plus缓冲液(H7033):
DNA的互补链(探针)用于检测应存在于膜上的目标序列。来自两种不同来源的DNA组合形成“杂合”dsDNA,但前提是这两条链是同源的。
Northern印迹实验方案类似于Southern印迹实验方案,只是RNA序列是在掺入甲醛的变性琼脂糖凝胶上分离。
如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中,则可以在运行后立即获得凝胶图像。
转膜设置、预杂交、杂交和检测的实验方案与Southern blotting相同。
如要继续阅读,请登录或创建帐户。
暂无帐户?